El número de neuronas monitoreadas usando este método permite la recopilación de datos de la red neuronal que sería imposible usando métodos más antiguos u otros. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de monitorear casi 2, 000 neuronas sensoriales primarias a la vez, respondiendo directamente a los estímulos aplicados a la pata trasera. Este procedimiento es especialmente adecuado para estudiar intervenciones terapéuticas para la alodinia periférica y la hipersensibilidad al dolor.
Este método puede adaptarse para estudiar los ganglios trigéminos o geniculados o usarse con sensores codificados genéticamente para moléculas de voltaje o señalización celular, como el AMP cíclico. Se necesita práctica para realizar esta cirugía. Puedes practicar en hasta seis ganglios de la raíz dorsal en un solo animal.
Demostraré el procedimiento seré yo, con la asistencia de John Shannonhouse y el Sr. Rubén Gómez. Para comenzar, coloque el mouse en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 grados centígrados. Localiza el agrandamiento lumbar palpando el hueso pélvico del ratón.
Luego, afeite la parte posterior del mouse por encima del área de agrandamiento lumbar. Con unas tijeras, haga una incisión rectangular de tres lados por encima del agrandamiento lumbar y doble la piel con fórceps. Use las tijeras de disección de resorte de 13 milímetros para hacer incisiones de tres a cuatro milímetros en el lado derecho de la columna vertebral.
Use tijeras para cortar la piel y los músculos a los lados para exponer la columna vertebral. Luego, usando tijeras de ocho milímetros, corte el músculo y el tejido conectivo para limpiar el proceso transversal del lado derecho L5 DRG. Trate de minimizar el sangrado usando algodón o espuma de gel para absorber la sangre.
Corte el proceso transversal L5 del lado derecho utilizando rongeurs de Friedman-Pearson o pinzas finas fuertes, teniendo cuidado de no tocar el DRG. A continuación, mueva el mouse y la almohadilla térmica a la etapa personalizada. Use cinta adhesiva para asegurar al animal y la almohadilla térmica en su lugar.
Coloque la nariz del animal en el cono de la nariz para la anestesia continua con isoflurano. Asegure la pata trasera derecha sobresaliendo a una posición fuera del escenario para facilitar la aplicación de los estímulos. Asegure la columna vertebral en su lugar con las pinzas de la etapa sobre la piel de las vértebras o el hueso pélvico justo rostral y caudal hasta el DRG L5.
Ajuste las abrazaderas y la plataforma para que la superficie del DRG esté lo más nivelada posible. Luego, coloque la etapa debajo del microscopio para que el objetivo esté directamente ocho milímetros por encima del DRG cuando se baje. Inserte el termómetro rectal.
Conecte las líneas eléctricas a la almohadilla térmica y al termómetro rectal. Conecte el cono de la nariz a las líneas de gas isoflurano. Utilice un microscopio confocal vertical con un objetivo DIC de 10x 0,4 y el software asociado para la obtención de imágenes.
Utilice la configuración del filtro verde FITC de excitación a 495 nanómetros, emisión a 519 nanómetros y longitud de onda de detección entre 500 y 580 nanómetros. Bajo el microscopio, encuentre la superficie del DRG. Ajuste las abrazaderas en el escenario para que la superficie DRG esté lo más nivelada posible y el área de superficie máxima se visualice en el plano focal.
Controle al animal durante todo el procedimiento para mantener la anestesia con isoflurano sin sobredosis. Para cargar el protocolo de escaneo rápido del microscopio, use la configuración típica de tamaño de vóxel 2.496 por 2.496 por 16 micras, 512 por 512 píxeles, 10 pila Z de corte óptico, una unidad Airy para 32 micrómetros, 1% de potencia láser de 488 nanómetros y cinco milivatios, tiempo de píxeles 1.52 microsegundos, tiempo de línea 0.91 milisegundos, tiempo de cuadro 465 milisegundos, velocidad de escaneo LSM de ocho, escaneo bidireccional, ganancia del detector PMT de 650 voltios y ganancia digital de uno. Realice un breve escaneo de ocho ciclos del DRG haciendo clic en Iniciar experimento en la pestaña Adquisición.
Cree una película haciendo una proyección ortogonal de escaneos a un escaneo por fotograma a lo largo del tiempo. Compruebe manualmente la claridad de la imagen y los artefactos de imagen, como las ondas de brillo que cruzan el DRG. Ajuste la posición de la abrazadera y el grosor de la sección óptica, y repita este paso hasta que se logre una película clara y de alta calidad.
Luego, cargue el protocolo de escaneo de alta resolución del microscopio utilizando la configuración típica de tamaño de vóxel 1.248 por 1.248 por 14 micras, 1024 por 1024 píxeles, seis pilas Z de corte óptico, unidad Airy de 1.2 o 39 micrómetros, 5% de potencia láser de 488 nanómetros y 25 milivatios, tiempo de píxeles 2.06 microsegundos, tiempo de línea 4.95 milisegundos, tiempo de fotogramas 5.06 segundos, velocidad de escaneo LSM de seis, escaneo bidireccional, ganancia del detector PMT a 650 voltios y ganancia digital de uno. Haga clic en el botón Iniciar experimento en la pestaña Adquisición para crear una imagen de alta resolución del DRG. Cargue el protocolo de escaneo rápido del microscopio y registre la actividad espontánea en el DRG durante 80 ciclos.
Genere una película de proyección ortogonal y verifique que la imagen sea de calidad suficiente para el análisis. Para aplicar estímulos, configure el microscopio para realizar de 15 a 20 exploraciones. Espere a que se completen los escaneos del uno al cinco para producir la línea de base.
Aplique el estímulo durante las exploraciones de seis a 10. Espere al menos cinco minutos después de cada estímulo antes de aplicar el siguiente para evitar la desensibilización. Para una prensa mecánica, sostenga la pinza del algometro con la pata entre las paletas sin tocar la pata.
Pellizque la pata comenzando inmediatamente después del final de la exploración cinco y deteniéndose inmediatamente después de la exploración 10. Controle la fuerza de prensa con un algometro y asegúrese de que no exceda los 10 g por encima de la fuerza deseada. Para estímulos térmicos, caliente un vaso de precipitados de agua justo por encima de la temperatura deseada.
Cuando el agua esté a la temperatura correcta, aplique el estímulo inmediatamente después del escaneo cinco sumergiendo la pata en el agua. Tire del vaso de precipitados inmediatamente después de escanear 10. La exposición quirúrgica a L5 DRG seguida de microscopía confocal permitió obtener imágenes de hasta 1.800 neuronas a la vez utilizando ratones Pirt-GCaMP3.
Las neuronas sensoriales primarias se observaron en un conjunto a nivel poblacional para transitorios espontáneos de calcio en ausencia de estímulos y en respuesta a estímulos en su contexto fisiológico normal. Los estímulos fuertes o el calor nocivo aumentaron las respuestas de calcio. En comparación con el prensado con 100 g, el prensado con 300 g aumentó el número de neuronas que producen transitorios de calcio y el área delta F por F0 bajo la curva.
El calor cálido en un rango de temperatura no nociva de 21 y 45 grados centígrados aumentó el número de neuronas que producen transitorios de calcio y el área delta F por F0 debajo de la curva. Las temperaturas no nocivas activaron un número menor de neuronas que producen transitorios en comparación con un estímulo de calor nocivo a 57 grados centígrados. Además, las neuronas de diámetro más pequeño y mediano produjeron calcio transitorio espontáneamente y bajo todos los estímulos, pero las neuronas de mayor diámetro solo produjeron transitorios de calcio en respuesta al estímulo de presión de 300 g.
El DRG debe estar nivelado y tener un grosor de corte óptico óptimo. Debe ser tal que pueda detectar el número máximo de celdas y no haya ondulación en la película. Esta técnica se ha utilizado para analizar modalidades sensoriales a nivel poblacional para la somatosensación y el gusto y para estudiar neuronas adyacentes que se activan en pares o en grupos sincronizados que contribuyen al dolor crónico y neuropático.
