Para empezar, toma HEK293T cultivadas de la incubadora. Aspire los medios de cultivo existentes de cada pocillo y agregue dos mililitros de medio fresco por pocillo. Para transfectar las células con ADN plásmido de bucle R dividido, mezcle el ADN y el PEI en 200 microlitros de DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para cada pocillo.
Agite rápidamente el ADN y el PEI en el nivel ocho durante aproximadamente dos segundos para asegurarse de que se mezclan bien y forman un complejo. A continuación, gírelo brevemente en una mini centrífuga. Después de la incubación, deje caer la mezcla sobre la superficie del medio de cultivo en la placa de seis pocillos que contiene las células.
Golpee suavemente la placa para distribuir uniformemente la mezcla e incube en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Después, retire la placa de seis pocillos de la incubadora, aspire el medio y lave cada pocillo con dos mililitros de DPBS. Una vez retirado el DPBS, añadir 350 microlitros de rojo fenol al 0,05%tripsina-EDTA.
Al final de la incubación, agregue 1,7 mililitros de medio a cada pocillo para detener la reacción de tripsina. Ahora, transfiera las células junto con el medio a un tubo de 50 mililitros y centrifugue a 300 g durante cinco minutos en una centrífuga de mesa. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet de celda con un mililitro de medio fresco.
Para sembrar las células en una placa de 96 pocillos recubierta de poli-D-lisina, agregue el volumen necesario de células en un tubo de 50 mililitros junto con el volumen adecuado de medio. Con una pipeta multicanal, dispense 100 microlitros de la suspensión celular diluida en cada uno de los 96 pocillos. Incubar las células durante 18 horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
