Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck.

1. Creación de plásmidos <ol><li> Subclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, ​​utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al 13. </li><li> Secuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios. </li><li> Realizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que las proteínas de fusión conservan su actividad biológica. En el caso que aquí se presenta la localización subcelular de las proteínas de fusión YFP se determinó por microscopía de fluorescencia. </li><li> Hacer plásmidos de expresión de las proteínas de control apropiadas Luc y YFP mediante el diseño de las señales de orientación pertinentes en los vectores de expresión pLUC y pYFP. En el caso que aquí se presenta, generar constructos Luc y YFP-nucleares dirigida por la inserción de una señal de localización nuclear en los vectores pLUC y pYFP. </li><li> Haceruna construcción de control positivo en el que Luc y YFP se funden en un único polipéptido. En el caso que aquí se presenta, generar un control positivo en el que se inserta la secuencia de codificación de YFP en el vector pLuc. </li><li> Seleccionar un plásmido de relleno neutro para ser utilizado para igualar la masa de ADN en las mezclas de transfección. Utilice un plásmido que no tiene promotor eucariota y por lo tanto será transcripcionalmente inactivo en células de mamífero, tales como un vector de clonación bacteriana. </li></ol> 2. Preparación de ADN Mezclas <ol><li> Estimar la concentración de todos los plásmidos descritos en la Sección 1 basado en la absorbancia a 260 nm (1 unidad de absorbancia es equivalente a 50 g / ml de ADN). Determinar la masa molecular de cada plásmido de multiplicar el número de pares de bases por 650 Da. Utilice la concentración y masa molecular para calcular la concentración molar de cada preparación de plásmido. Diluir las preparaciones de ADN de plásmido a una concentración de 36 nM. Estas serán las reservas de trabajoque se usan para preparar las mezclas de ADN para la transfección. </li><li> Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 1.800 ng de plásmido de relleno en un volumen final de 20 l de agua. </li><li> Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de la construcción-el control pLuc. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l. </li><li> Preparar una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de constructo de control de pLuc y 5 l de constructo de control de pYFP. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l. </li><li> Prepare una mezcla de ADN de control que contiene 5 l de construcción de control positivo. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l. </li><li> Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de homodimerización de una proteína de interés, X. Para cada mezcla de ADN combinar 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construir. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l. A)-Control pLuc y pYFP-X B) pLuc-X y control pYFP C) pLuc-X y X-pYFP </li><li> Prepare el siguiente ADN se mezcla para la prueba de una interacción entre un par de proteínas de interés, X e Y. Para cada mezcla de ADN se combinan 5 l de la pLuc relevante construir y 5 l de la pYFP construyen. Añadir plásmido de relleno para aumentar el peso total de ADN a 1800 ng. Añadir agua para llevar el volumen final a 20 l. A)-Control pLuc y pYFP-X B) pLuc-X y control pYFP C) de control de pLuc y pYFP-Y D) pLuc-Y y-control de pYFP E) pLuc-X e-Y pYFP F) pLuc-Y y pYFP-X </li></ol> 3. Transfección <ol><li> Harvest Subconfluent células HEK293 de un frasco de 75 cm2. Diluir 10% del total de células en 13 ml de medio de cultivo. Dispensar 130 l de suspensión celular en cada pocillo de un blancofondo transparente de 96 pocillos placa de cultivo de tejidos. Cultivar las células durante 24 horas. </li><li> Calcular el número de pozos a ser transfectadas multiplicando el número de mezclas de ADN por 3. Traer medio de cultivo libre de suero a temperatura ambiente. Preparar una mezcla maestra que contiene 6,3 l de medio libre de suero y 0,18 l de reactivo de transfección por pocillo. Mezclar por agitación e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Preparar las mezclas de transfección mediante la adición de 2 l de mezcla de ADN a 20 l de medio / transfección mezcla maestra reactivo libre de suero. No vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Transfectar tres pozos con cada mezcla de transfección dispensar 6,5 l de mezcla de transfección por pocillo. Cultivar las células de un 36 a 48 horas más. </li></ol> 4. Medición de la señal BRET <ol><li> Disolver sustrato de luciferasa de células vivas a 34 mg / ml en DMSO por vórtex. </li><li> Diluir sustrato de luciferasa de células vivas reconstituido a 1:1.000 en sustrato dilución medio pre-calentado a 37 ° C. Permitir 50 l de medio de dilución de sustrato por pocillo. Vortex para mezclar. Puede formarse un precipitado, pero no va a interferir con el ensayo. </li><li> Aspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos. Dispensar 50 l de sustrato de luciferasa de células vivas diluido en cada pocillo. Células de cultivo durante al menos 2 horas (hasta 24 horas). </li><li> Retire la tapa de la placa de 96 pocillos y se incuba la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente en el interior del luminómetro. </li><li> Medida de emisión de Luc y YFP un pozo a la vez. Medida de emisión de Luc usando un filtro de bloqueo de longitudes de onda más larga que 470 nm. Medida de emisión de YFP utilizando un filtro de paso de banda de 500-600 nm. Integrar las señales de emisión durante 10 s. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Promedio de las lecturas de emisión Luc de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones Luc para producir los valores de emisión de Luc fondo-resta.</li><li> Promedio de las lecturas de emisión de YFP de los 3 pocillos que recibieron sólo el plásmido de relleno. Reste este valor de todas las otras lecturas de emisiones YFP para producir los valores YFP emisión de fondo-resta. </li><li> Para cada pocillo, se divide el YFP valor de fondo-resta la emisión por el valor Luc fondo-resta de emisión para dar la relación de BRET sin corregir. </li><li> La media de los coeficientes de BRET no corregidas de los tres pozos que fueron transfectadas con sólo el plásmido de control pLuc. Restar este valor de todas las otras relaciones de BRET no corregidos para dar las proporciones de BRET corregidos. </li><li> Para cada uno de los restantes conjuntos de relaciones de BRET corregidos, el promedio de los valores de los tres pozos transfectadas para obtener una relación BRET final. </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de p...

Tanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo humano. La proyección a gran escala de uso más frecuente se acerca para la identificación de los compañeros de interacción candidatos para las proteínas de interés son la levadura de dos híbridos de 1 y proteómica basada en la espectrometría de masas 2. Estos métodos pueden ser muy exitosos en lo que sugiere que interactúan las proteínas potenciales, pero are vulnerable a resultados positivos falsos. Por lo tanto, la confirmación de una interacción identificado por levadura de la espectrometría de masas de dos híbridos o requiere la validación de la interacción utilizando una segunda técnica. Normalmente, un co-inmunoprecipitación o ensayo de pull-down se utiliza para este fin 3. Una desventaja del uso de tales técnicas para la validación es el requisito para la lisis celular, que destruye las condiciones intracelulares que pueden ser esenciales para el mantenimiento de ciertas interacciones proteína. Una segunda desventaja es que las interacciones débiles o transitorios de proteína pueden ser interrumpidos durante los pasos de lavado. Además, estos ensayos exigen práctica en tiempo significativos, están limitados en el número de muestras que se pueden procesar de forma simultánea, y a menudo requieren la optimización de tiempo de los reactivos y protocolos. Para superar algunos de los problemas asociados con experimentos de co-inmunoprecipitación, varios ensayos se han desarrollado sobre la base de fluorescente y bioluminescent proteínas que se pueden utilizar en células vivas. El primero de estos ensayos se basan en la fluorescencia (o Förster) Transferencia de energía de resonancia (FRET), la transferencia no radiante de energía entre dos proteínas fluorescentes con la superposición de espectros de emisión y de excitación 4. La eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, por lo tanto, la observación del fenómeno de FRET requiere que los fluoróforos donador y aceptor estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés, una proteína se expresa como una fusión con el fluoróforo donante (proteína fluorescente cian comúnmente; PPC) y el segundo como una fusión con el fluoróforo aceptor (proteína fluorescente amarilla comúnmente; YFP). Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar a los donantes y aceptor fluoróforos suficientemente próximos para que se produzca la transferencia de energía, lo que resultará en un aumento mensurable en la emisión de luz desde el aceptor YFP en relación con el donante de la PPC. FRET ha tenido éxito en la detección de interacciones proteína-proteína en células vivas 4. El principal inconveniente del uso de FRET para la detección de interacciones proteína-proteína es el requisito para la iluminación externa para la excitación del fluoróforo donante. Resultados de la iluminación interior en gran fondo en la señal de emisión, excitación no deseada del aceptante, y fotoblanqueo del donante y aceptor fluoróforos. Estos efectos reducen la sensibilidad del ensayo para la detección de interacciones proteína-proteína. Una modificación del ensayo de FRET, que supera el problema de alto fondo de la iluminación externa es la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) 5,6 ensayo. En el sistema de BRET el fluoróforo donante se sustituye por una enzima luciferasa. Así, la energía para la excitación del fluoróforo aceptor se genera dentro del sistema por la oxidación de un sustrato de luciferasa, lo que hace innecesaria la iluminación externa. En el másconfiguración común de este ensayo, el donante es luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es YFP (para una discusión de la alternativa de donantes y aceptores de proteínas ver Pfleger et al. 5). De acuerdo con ello, en este sistema, una proteína de interés se fusiona con una proteína luciferasa y potencialmente interactuar a YFP, o viceversa. El ensayo BRET requiere la adición de coelenterazina como sustrato para la luciferasa. Debido a que la coelenterazina es permeable a las células, es posible llevar a cabo ensayos de BRET en células vivas. Sin embargo, coelenterazina nativa es inestable en solución acuosa, y el desglose-enzima independiente de coelenterazina tanto reduce la concentración de sustrato disponible para el ensayo y genera autoluminiscencia, lo que reduce la sensibilidad de las mediciones de la actividad de luciferasa. El uso de BRET en células vivas ha sido facilitado por el desarrollo de coelenterazines protegidas, que son estables en solución acuosa, pero se escinden por esterasas citosólicass después de la difusión a través de la membrana de la célula para generar coelenterazina activo dentro de la célula 7. Después de la adición de sustrato a las células que expresan luciferasa y las proteínas de fusión-YFP, la transferencia de energía resultante de las interacciones proteína-proteína se cuantificó mediante el control de la emisión de la luciferasa y YFP. Debido a las interacciones de proteínas se pueden monitorizar directamente en células vivas en placas de múltiples pocillos, el ensayo BRET constituye un método simple y escalable para la validación de las interacciones putativo que es el costo y eficiente en el tiempo. Además de validar interactores putativos identificados en estudios de cribado proteómicos, el sistema de BRET también se puede utilizar para candidatos a elementos interactuantes prueba de derivados de estudios bioquímicos y estructurales previas sobre la proteína de interés. Una vez que la existencia de una interacción proteína-proteína se ha establecido (ya sea usando el ensayo BRET o por otras técnicas), existe un potencial para el ensayo BRET para ser EMPLoyed más para caracterizar la interacción. Por ejemplo, las regiones que interactúan se pueden asignar mediante la generación de versiones truncadas de las proteínas, y la participación de residuos específicos en la interacción se puede demostrar mediante la creación de mutaciones puntuales. Además, el efecto modulador de modificaciones postraduccionales o pequeñas moléculas (tales como fármacos o ligandos) sobre las interacciones proteína-proteína puede ser investigado 8-10. El ensayo BRET también tiene un gran potencial para la investigación de mutaciones identificadas en el ADN del paciente. En los casos en que se ha establecido un papel causal para una mutación, estudiar el efecto de la mutación en las interacciones proteína-proteína utilizando BRET puede revelar más acerca de la etiología molecular de la fenotipo 11. Desde el advenimiento de las metodologías de secuenciación de próxima generación, cada vez es más común para varias mutaciones potencialmente dañinos que se identifiquen dentro de un individuo, en cuyo caso no está claro cuáles son releVant para el fenotipo 12. En esta situación el ensayo BRET puede ser valiosa en la evaluación del impacto de las mutaciones en la función de las proteínas y, por tanto, su importancia para el trastorno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Los ensayos basados ​​en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un &quot;donante&quot; de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.

El principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4). Nuestra investigación se centra en el papel de la fami...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K vistas.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados. 

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Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigación

Biología

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...