Para comenzar, obtenga los parásitos en etapa de anillo sincronizados con sorbitol de plasmodium falciparum. Preparar 50 mililitros de tampón cytomix 2x y diluirlo 1 a 1 con agua estéril. A continuación, lave 100 microlitros de glóbulos rojos parasitados en etapa anular empaquetada dos veces con 5 mililitros de tampón cytomix 1X y centrifuérrelos a 994 g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Después de eliminar el tampón, agregue 50 microgramos de cada plásmido en las células, seguido de un volumen apropiado de tampón 2x. Ajuste el volumen a 400 microlitros con 1x tampón antes de transferir la solución preparada a cubetas de 0,2 centímetros para cada transfección. Luego, electropore las células con cuidado.
Después de la electroporación, mezcle e incube las células con medio RPMI completo en un matraz T25 con un volumen total de 15 mililitros. A continuación, centrifugar los parásitos transfectados en un tubo cónico de 50 mililitros a 994 g durante tres minutos. Después de eliminar el sobrenadante, lave los parásitos con 10 mililitros de RPMI incompleto.
Cultivarlos con RPMI completo fresco durante dos días, reponiendo el medio después de 24 horas. Después de 48 horas, retire el RPMI completo de cada matraz. Volver a suspender el cultivo en RPMI completo adicionado con fármacos.
Incubar el cultivo en un matraz T75 junto con 400 microlitros de glóbulos rojos frescos durante quince días El día 14, alícuota 200 microlitros del cultivo transfectado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar el sobrenadante, transfiera las células a un portaobjetos y coloque otro portaobjetos en un ángulo de 45 grados para hacer un frotis.
Después de la fijación con metanol, sumergir el portaobjetos en el tinte de Giemsa durante 20 minutos. Lave el portaobjetos con agua corriente y séquelo bien. Observe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con un aumento de 100x después de aplicar el aceite de inmersión.
Una vez que se visualicen los parásitos, reponga el medio diariamente durante dos o tres días.
