Para empezar, pipetee 1,5 mililitros de la solución de yoduro de propidio de 0,1 miligramos por mililitro en cada pocillo de la guía de electrodos. Coloque un inserto en cada pocillo de la guía de electrodos, encajando los pies del inserto en las ranuras de alineación para que el inserto quede al ras con la superficie superior del pocillo. Atornille la placa de circuito impreso del electrodo superior a la parte superior de los pocillos de la matriz de electrodos y conecte la guía de electrodos al dispositivo de electroporación de sustrato poroso o PSEP.
Coloque la guía de electrodos en la incubadora a 37 grados centígrados para equilibrar la temperatura. Haga clic en el menú desplegable junto a la membrana en la esquina superior izquierda de la GUI y haga clic en GBO de 400 nanómetros. En el lado derecho de la GUI, escriba uno en el campo de edición de minutos de duración del tiempo de pulso posterior.
Ahora, haga clic en el botón de ejecución e ingrese los nombres apropiados para los pozos uno a tres y cuatro a seis cuando se le solicite. A continuación, haga clic en Aceptar para iniciar el experimento. Después de una hora, retire la guía de electrodos de la incubadora y transfiera los insertos a las ubicaciones originales en la placa de experimento.
Mezcle dos microlitros de Hoechst 33342 y cinco microlitros de calceína AM con 123 microlitros de medios de cultivo celular en un tubo de 200 microlitros. Pipetee suavemente 10 microlitros de la solución de tinción en cada inserto de pulso posterior y vuelva a colocar los insertos en la incubadora durante cinco minutos. Transfiera la placa de pocillos al soporte de placas de un microscopio fluorescente con un objetivo de aumento de 5x.
Imagen utilizando el campo claro y la fluorescencia de cada tinción. Pipetee 1,5 mililitros del medio de cultivo celular en cada pocillo de la guía de electrodos. Coloque los insertos de muestra de celda en los pocillos uno a tres y los insertos de control en los pocillos cuatro a seis, encajando los pies del inserto en las ranuras de alineación.
Atornille la placa de circuito impreso del electrodo superior a la parte superior de los pocillos de la guía de electrodos y conecte la guía de electrodos al dispositivo PSEP. Coloque la guía de electrodos en la incubadora a 37 grados centígrados para equilibrar la temperatura. Haga clic en el menú desplegable junto a membrana en la esquina superior izquierda de la GUI y haga clic en GBO de 400 nanómetros.
Ahora, haga clic en el botón de ejecución e ingrese los nombres apropiados para los pozos uno a tres y cuatro a seis cuando se le solicite. A continuación, haga clic en Aceptar para iniciar el experimento. Después de una hora, retire la guía de electrodos de la incubadora y transfiera los insertos a las ubicaciones originales en la placa de pocillos del experimento.
Después de preparar Hoechst 33342, calceína AM y yoduro de propidio en medios de cultivo celular, mezcle y pipetee suavemente 10 microlitros de la solución de tinción en cada inserto de pulso posterior y vuelva a colocar los insertos en la incubadora durante cinco minutos. En un microscopio fluorescente, obtenga imágenes de las inserciones de la muestra celular utilizando el campo claro y la fluorescencia de cada tinción. La curva saludable optimizada no mostró ninguna caída por debajo de la línea de base y el mayor aumento en TEEI.
Las imágenes posteriores a la PSEP de la monocapa celular revelaron una muerte celular insignificante y una monocapa celular sana y completamente confluente. Los datos incorrectos optimizados dieron como resultado una respuesta TEEI disminuida. Las imágenes posteriores a la PSEP revelaron una muerte celular casi nula y una reducción de la eficiencia de entrega debido a la menor cantidad de células en la monocapa.
La aplicación de formas de onda no optimizadas dio lugar a disminuciones significativas en la respuesta de TEEI, lo que indica una muerte celular sustancial y una disminución de la eficiencia de entrega.
