Para empezar, incruste la larva transgénica en agarosa de bajo punto de fusión en una placa de micropocillos con fondo de vidrio. Coloque el plato en la platina microscópica del microscopio invertido. Coloque y enfoque la región deseada para la ablación en el centro del campo de visión.
Elija la configuración de la pila Z para obtener una imagen de toda la anchura del opérculo. Obtener una imagen del área de interés del opérculo antes de la ablación. A continuación, dibuje una región circular con un diámetro de 25 micrómetros en un plano 2D seleccionado.
Concéntrese en el opérculo utilizando la región de interés o la herramienta ROI. Para realizar la ablación, aplique una potencia de ablación medida sin objetivo a 450 milivatios durante 10 segundos. Exponga el área seleccionada al láser de dos fotones.
Después de la ablación, confirme la ablación estructuralmente mediante la obtención de imágenes de la misma pila Z con los mismos ajustes, como se utilizó antes de la ablación. Con pinzas o una aguja de disección, retire las larvas con cuidado de la agarosa de bajo punto de fusión. Primero, retire una capa de agarosa que cubre las larvas.
En segundo lugar, retire la agarosa en contacto directo con las larvas. Vuelva a colocar las larvas en un plato con medios E3 puros. A las cuatro o seis horas después de la lesión, vuelva a tomar imágenes del área del opérculo utilizando larvas incrustadas en agarosa con la misma configuración en el mismo microscopio.
Después de procesar las imágenes en Fiji, cuantifique las células con una etiqueta nuclear, o midiendo el área, en caso de que las células se superpongan. Para cuantificar el área, cree una máscara que abarque los macrófagos. Utilice la herramienta Imagen, Ajustar, Umbral, Crear un ROI y analice las partículas.
Luego, mide el área. Genere gráficos que representen los resultados de las mediciones utilizando un software adecuado. Se detectó una acumulación significativa de macrófagos en la región del opérculo ablacionado seis horas después de la ablación en larvas de seis días después de la fertilización.
En las larvas cuatro días después de la fertilización, el número de macrófagos aumentó a las cuatro horas después de la lesión. El número y el área de macrófagos aumentaron a las cuatro horas después de la lesión en comparación con el estado no ablacionado.
