We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense &#8211; USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

El pez cebra (cepa nácar) fueron criados y se crió según los protocolos establecidos. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento, utilizando 0,4 mM tricaína para la anestesia y 1 tricaína mM para la eutanasia. Embriones de pez cebra y larvas fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales según lo aprobado por la comisión competente (Laboratorio Biológico MDI animales núcleo CICUAL número 13-20). Este estudio fue aprobado por el Instituto de Investigación del Genoma Humano Cuidado de Animales y el empleo Comisión Nacional, MDIBL Aseguramiento Institucional # A-3562-01 bajo el protocolo # 14-09. Nota: El procedimiento de imagen que captura la regeneración de la aleta en larvas de pez cebra se resume en los siguientes pasos: 1. Aumento de pez cebra a fases larvarias <ol><li> Recoger los huevos y coloque aproximadamente 50 huevos en una placa de Petri de 100 x 25 mm que contiene 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada suplementado con 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N en una incubadora a 28,5 °. </li> &lt;li&gt; A la mañana siguiente a eliminar los embriones muertos con una pipeta de vidrio y enjuague los huevos en un colador con un 0,03% de sal Instant Ocean en agua desionizada (medio embrión llamado). Nota: Medium, como timbres 18, Hanks 18, 19 E2, E3 20, y Danieau 21 puede ser preferible. </li><li> sup&gt; Añadir medio de embriones frescos al plato. Si la utilización de cepas pigmentadas, añadir opcionalmente 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), como PTU evitará la melanogénesis y por lo tanto la pigmentación de las larvas. Deje que los embriones se desarrollan más en la incubadora hasta 2 días después de la fecundación o cualquier otra etapa larval deseado. </li></ol> 2. Preparación de la cámara de imágenes <ol><li> Método 1: Imaging cámaras hechas de PVC o tubo de teflón (Figura 1) Nota: Este método es similar a la Concha y Adams (1998) 22. <ol><li> Adquirir plástico de calidad del agua de consumo o tubos de teflón en una ferretería con un exterior 25 mmda 20 mm de diámetro interior. Cortar el tubo para hacer anillos de aproximadamente 10 mm de espesor con una superficie uniforme en cada lado. Utilice&gt; 200 papel de lija para suavizar los bordes. </li><li> Limpie los anillos con agua tibia y etanol al 70% y dejar secar al aire. </li><li> Con una punta de pipeta, aplicar grasa de silicona a la mitad de un anillo y conecte el anillo a un 75 mm x 25 mm cubreobjetos de vidrio. También puede utilizar una jeringa de 3 ml lleno de grasa de silicona en lugar de una punta de pipeta. Nota: Debido a que es difícil insertar la grasa de silicona en la jeringa 3 ml, añadir la grasa de silicona a una jeringa de 30 ml primero y utilizar este para el llenado de la jeringa 3 ml. </li></ol></li><li> Método 2: Preparación de un plato Petri como una cámara de imágenes. <ol><li> Adquirir 35 o 60 mm de diámetro placas de Petri con un cubreobjetos de vidrio unido a la tapa (Figura 2A). Alternativamente, como se muestra en la Figura 3 de Distel y Koester (2007) 23, perforar una abertura lo suficientemente pequeño para hviejo un cubreobjetos en la tapa de una pequeña placa de Petri y aplicar grasa de silicona al exterior con una jeringa de 3 ml. Utilizando una punta de pipeta limpia, con cuidado colocar un cubreobjetos redondo o cuadrado de espesor deseado hacia el exterior (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para asegurarse de que la agarosa se utiliza para estancias firmemente unidos durante la elaboración de montaje, coloque una malla de plástico fino en el interior del anillo. En primer lugar, cortar la malla hecha de pantalla de la ventana obtenido a partir de una ferretería, en el tamaño del diámetro del anillo interior con unas tijeras finas con un ángulo. A continuación, cortar un pequeño rectángulo&gt; dos veces el tamaño de la larva en el centro de la malla (Figura 1, 2). </li><li> Aplicar cuatro pequeños puntos de grasa de silicona no tóxico para la interfaz entre la hoja de la cubierta y el anillo de la cámara (Figura 1A). </li><li> El uso de fórceps para sujetar firmemente la malla a la parte inferior de la cubreobjetos de vidrio. </li></ol> 3. Montaje e Imagen de la Pre-injured Larva (este paso es opcional) Nota: Este paso es adecuado para las comparaciones entre la longitud de la aleta amputada y regenerada, como el plano de amputación después de la regeneración de la aleta no es reconocible en larvas de pez cebra. <ol><li> Preparar una solución de agarosa al 0,5-1,2% bajo punto de fusión en medio de embrión para la inmovilización de la muestra. </li><li> Calentar la agarosa en un microondas y transferir la agarosa líquido en tubos de 1,5 ml que se pre-calienta a 42 ° C en un calentador. </li><li> Deje que la agarosa caliente, déjelo enfriar a 42 ° C, que puede mantenerse durante varias semanas a esta temperatura. Trate de evitar pipetear las larvas en agarosa encima 42 ° C, ya que esto será perjudicial para los animales. </li><li> Anestesiar a varias larvas usando 10 ml de 0,4 mM tricaína (pH 7) en medio de embrión en una placa de Petri de diámetro 60 mm. Prepare el tricaína según el Libro Recetas de pez cebra 18. <ol><li> Alternativamente, utilizar 10 ml de una dilución 1: 1000 de 99% 2-fenoxietanol en una placa Petri de diámetro de 60 mm. Meter las larvas con una punta de pipeta microloader nevadas para evaluar su respuesta al tacto antes de proceder. Utilice sólo las larvas no responde. </li></ol></li><li> Transferir una larva en la solución de gelosa a 42 ° utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. No transfiera líquido excesivo en la agarosa, de lo contrario la agarosa será demasiado diluida y se solidifica. </li><li> Deseche el líquido restante de la pipeta y transferir la larva con una gota de agarosa en una pequeña placa de Petri (35 o 60 mm de diámetro). Coloque la larva en su lado de la imagen de la aleta caudal. </li><li> Deje que la agarosa se solidifique. Evaluar la agarosa con una punta de pipeta de plástico; la punta se sumerja en la agarosa si es demasiado líquido. Una vez que la agarosa se ha solidificado, una pequeña hendidura será visible al tocar con la punta de la pipeta. Después de la solidificación, añadir solución tricaína y proceder al microscopio estereoscópico que se utilizará más tarde para time-lapse. <li> Utilice un microscopio estereoscópico con el software de lapso de tiempo. Seleccione un objetivo y ampliación apropiado, que se utilizará más tarde para time-lapse. En este caso, utilice un 3,5 x 16 mm, distancia de trabajo de la lente objetivo en un microscopio estereoscópico. Según se desee, utilizar microscopios alternativos y lentes de objetivos, sino elegir un aumento adecuado para tener en cuenta el potencial xy de la deriva y el crecimiento de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes. </li><li> Seleccione el modo de detección de la cámara en el microscopio. </li><li> En el software, seleccione el modo &quot;en vivo&quot; para ver la larva en la pantalla. </li><li> Abra la ventana &quot;Propiedades&quot; para detectar automáticamente el brillo. </li><li> Para ajustar manualmente el contraste en la base trans-iluminación microscopio. </li><li> Mueva la larva del campo de visión y seleccione la función de corrección de sombreado para minimizar fondo noise. </li><li> Coloque la larva de nuevo en el campo de visión y tomar una instantánea. Guarda la imagen. </li><li> Retire la agarosa de la larva por primera raspando la agarosa de la cabeza. De esta forma la larva puede deslizarse fuera de la agarosa tirando suavemente la cabeza lejos de la agarosa restante con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. </li><li> Con una pipeta Pasteur de vidrio transferir la larva en una solución tricaína fresco. </li></ol> 4. Amputación Ensayo <ol><li> Preparar una solución de agarosa al 1,5% usando medio de embrión y se vierte una capa delgada en una placa de Petri. Deje que la agarosa se solidifique. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, coloque el lateral larva en la agarosa solidificada y amputar la aleta de la cola con una G aguja de la jeringa 23 con una ligera presión (Figura 3A). </li></ol> 5. Montaje de la Larva de time-lapse <ol><li> Proceda como se describe en los pasos 3.1 a 3.5 (Figura 3B). </li><li&gt; Transferir una caída de 0,5 a 1,2% de agarosa líquida a 42 ° C que contiene la larva en el anillo de la cámara de imágenes (paso 2.1), oriente la larva y dejar que la agarosa se solidifique. Llene el anillo con solución tricaína. Alternativamente, si se utiliza la cámara de placa de Petri (paso 2.2), montar la larva en el cubreobjetos tapa y llenar la tapa con solución tricaína. </li><li> Para permitir la cicatrización de las heridas o la regeneración de tejidos que se produzca, raspar con cuidado la agarosa que rodea la aleta de la cola distal con una punta de pipeta microloader tapado o un pasador de insectos. Trate de no lesionar la aleta repetidamente (Figura 3C). </li><li> Decantar la solución tricaína contiene el eliminado de agarosa y llenar el anillo de la cámara con solución tricaína fresco. </li><li> Aplicar grasa de silicona a la parte superior del anillo y adjuntar una cámara de 75 mm x 25 mm portaobjetos de vidrio. Trate de evitar las bolsas de aire en la cámara, ya que interferirán con las imágenes de campo claro y desecar la larva en el tiempo. </li><li> Si se utiliza una placa de Petri comouna cámara de formación de imágenes, se aplica grasa de silicona para el borde superior de la cámara inferior y llenar la cámara inferior con la solución de tricaína. Decantar cuidadosamente la solución tricaína en la tapa y gire la tapa sobre sumergir la larva en la solución tricaína de la cámara inferior en un ligero ángulo para evitar bolsas de aire. La cámara será sellado debido a la grasa de silicona. </li></ol> Imagen 6. Time-lapse <ol><li> Montar una cámara de incubación se calienta como se describe en 23,24 (Figura 4) .Colocar la cámara de incubación alrededor del microscopio y encender la calefacción. Ajustar la temperatura a 28 ° C durante aproximadamente 10 a 20 minutos o hasta que la temperatura se ha estabilizado. </li><li> Abra la parte delantera de la cámara de incubación climatizada y colocar la cámara de imágenes en el soporte microscopio con el cubreobjetos hacia arriba hacia el objetivo. </li><li> Coloque la aleta larval de una manera que 2/3 de la campo de visión permanece desocupado. Esto asegura la captura de lacrecimiento y la regeneración de la aleta en el transcurso del procedimiento de formación de imágenes sin tener que cambiar la posición de la larva. <ol><li> Ajuste la larva montado a 28 ° C durante ~ 30 minutos antes de iniciar la grabación a intervalos regulares para evitar cambios en la intensidad de campo claro o posibles cambios de la agarosa. Alternativamente, utilizar tampón de pre-calentado para comenzar de formación de imágenes después de corto tiempo de ajuste. </li></ol></li><li> Para configurar la grabación de lapso de tiempo, abra la ventana 6D Multidimensional Adquisición en el software Axiovision y seleccione la opción z-stack y time-lapse. </li><li> Opcional) En la pestaña z-pila y Modo Loncha, seleccione el grosor de corte y luego seleccionar el modo de inicio / parada. </li><li> Definir la posición superior e inferior de la pila. </li><li> En la pestaña de lapso de tiempo, seleccione el intervalo y la duración de la película y luego comenzar la película pulsando el botón de inicio. Encontramos que intervalos de 30 minutos son suficientes y este intervalo no genera datos excesivos; Sin embargo shorteintervalos R pueden ser utilizados. </li><li> Compruebe las dimensiones de posición y z-stack durante la primera hora si la larva no fue pre-ajustado. Si es necesario, vuelva a colocar la larva de nuevo después de un día, como la larva puede haber cambiado. </li><li> Guarde el archivo al final de la grabación a intervalos regulares y proceder con el post-procesamiento y cuantificaciones utilizando el software de análisis de imágenes disponibles, como Imaris 25 o el código abierto paquetes de software Image J 26 y 27 de Fiji. </li></ol> Análisis 7. Datos <ol><li> La determinación de la longitud de la aleta. <ol><li> Abre la película de lapso de tiempo en el software de imagen y guardar los archivos en el formato de archivo propietario para mejorar el rendimiento del software. </li><li> Seleccione la vista ortogonal a mostrar secciones individuales como pilas proyectadas. Para la corrección de la deriva, en el menú de Fiji, seleccione Complementos y Registro, y &#39;deriva 3D correcta&#39;. Esto abrirá una ventana de Fiji y realizar las correcciones de deriva. Correctoderiva de rotación en la función Spots Imaris. Alternativamente, instalar los plugins StackReg y TurboReg en la imagen J e importar a Fiji. Elija el algoritmo de transformación deseada en el plugin StackReg. </li><li> Para medir distancias (por ejemplo, diámetro de la herida o la longitud de la aleta), seleccione la opción &quot;agregar nuevos puntos de medición&quot; en la barra de herramientas de la izquierda superior. <ol><li> En &#39;lista Configurar de Estadísticas visibles Valores&#39; en el menú inferior izquierda, seleccione los valores de los estadísticos que se mostrarán. </li><li> En el &quot;Modo de línea&quot; bajo la pestaña Configuración, seleccione &#39;pares (AB, CD ...). </li><li> En &#39;Labels Propiedades&#39; select &#39;Nombre&#39; y &#39;Distancia&#39;, para mostrar la distancia entre los puntos A y B junto a la línea de medición. </li><li> Cambie al modo &quot;Editar&quot; y mantenga presionado el botón de desplazamiento para seleccionar el primer punto al final de la notocorda. A continuación, utilice la misma configuración para seleccionar el segundo punto en el margen distal de la aleta. </li><li> En la pestaña &quot;Estadísticas&quot;, seleccione el botón de disco (Exportar todo) en la parte inferior derecha para mostrar y exportar la distancia en la imagen. </li><li> Repita las mediciones a la hora seleccionada moviendo el deslizador por debajo de la imagen de la derecha. En lugar de crear nuevos puntos de medición, los anteriores se pueden reposicionar primero seleccionando el punto con el botón izquierdo del ratón, a continuación, al mismo tiempo presionando el desplazamiento y el botón izquierdo del ratón en la nueva posición. </li></ol></li><li> Como alternativa a la opción Puntos de Medición, utilizar el espectador rebanada para medir distancias. En el modo de vista de la rebanada, desplácese hasta la posición deseada y haga clic en la primera y segunda posición con el botón izquierdo del ratón. Se mostrará la distancia. Esta opción sin embargo no permite la exportación de datos. </li></ol></li><li> La determinación de longitud de la aleta y el área en ImageJ. <ol><li> Abre la película de lapso de tiempo en ImageJ usando un plugin que reconoce el formato de archivo .zvi. Como alternativa, cargue en un Quarchivo ickTime o secuencia tiff. Nota: Si utiliza un formato de archivo TIFF sin comprimir, las dimensiones de la imagen no es necesario que se determine. </li><li> Si la apertura de un formato de archivo diferente sin la información del archivo, seleccione &quot;Escala de Ajuste&quot; en el menú &quot;Analizar&quot; para definir primero la distancia de la imagen y la unidad. En el &#39;menú Escala Set&#39;, escriba el &#39;Distancia en píxeles &quot;, a continuación el tipo de la&quot; distancia Conocido&#39; para el valor de píxel (esto se puede obtener midiendo el número de píxeles en una barra de escala que se ha añadido a la imagen , a continuación, haga clic en Medir para obtener el resultado), y la &quot;Unidad de longitud &#39;(normalmente&#39; m &#39;). Luego haga clic en Aceptar. </li><li> Para mediciones de área de aleta seleccionar la herramienta &quot;Selección a mano alzada&quot; en la barra de herramientas y describen el área de la aleta manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras dibuja a lo largo del contorno de la aleta. Para mediciones de la longitud de la aleta, seleccione la herramienta de línea de &#39;Straight &quot;y trazar una línea entre los puntos deseados para sermedido. </li><li> Haga clic en la opción &quot;Medir&quot; en &quot;Analizar&quot; para visualizar el área y la longitud de la aleta. Repita este paso tantas veces como sea necesario para múltiples puntos de tiempo de la película. </li></ol></li><li> Utilizando las estadísticas de software, los datos pueden visualizarse gráficamente. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons.">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li><li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution.">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li><li>Distel, M., Babaryka, A., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy.">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado permite la observación de la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en que viven las larvas de pez cebra con imágenes in vivo de lapso de tiempo en un microscopio estereoscópico campo claro, utilizando una relativamente sencilla configuración. Este procedimiento requiere ciertos aspectos importantes que hemos probado, que optimicen el resultado: 1) las concentraciones de agarosa de bajo (~ 0,5%) reducirá al mínimo los obstáculos de crecimiento del continuo crecimiento larvas de pez cebra, 2) Eliminación de la agarosa alrededor de la aleta es importante no a oscurecer el proceso de curación, 3) Atrapar la agarosa en una malla de plástico retiene la agarosa y animal en una posición estable durante todo el procedimiento, y 4) Un entorno de temperatura controlada adecuada, que es esencial para la viabilidad de las larvas. Hemos adaptado una cámara calentada de incubación 23,24, que utiliza plástico de burbujas que se grabó en un cartón, y un calentador de cúpula de cable para controlar la temperatura y la circulación de aire adecuada con fluctuaciones mínimas durante elprocedimiento de imagen. Esta cámara sencilla y rentable puede ser preparado para adaptarse a cualquier microscopio. Una cámara de incubación climatizada similar ha sido también utilizada para los ratones de imagen y desarrollo del polluelo 24,29. Sugerimos que las larvas previamente amputada se montan una imagen pre-amputación para, desmontar para la amputación, y remontamos por time-lapse. Aunque es factible realizar estos pasos en un solo paso en la cámara de formación de imágenes final, en nuestra experiencia, se encontró que la amputación de la aleta de la cola en un cubreobjetos de vidrio no es óptimo, ya que desgarra el tejido y no da lugar a un corte limpio. El método basado en la amputación de agarosa utilizando una aguja de jeringa fue descrito originalmente por Kawakami y colaboradores (2004) 16 y es también, en nuestra experiencia, ideal para llevar a cabo las amputaciones. Por lo tanto, la más complicada serie de pasos que presentamos está bien justificada y garantiza un resultado óptimo regeneración. Demostramos que larval pez cebra en 2 dpf se pueden obtener imágenes de hasta 1,5 días en agarosa y solución tricaína. Nos tricaína (pH 7) solución de pH optimizado preparado con sal Instant Ocean, que no interfiera con la salud de la muestra durante el período de formación de imágenes presentado acostumbrados. Previamente, sin embargo también demostró que el uso de tricaína en medio Danieau permite time-lapse de 2,5 dpf larvas de pez cebra en un microscopio confocal de al menos 2 días 30. Por lo tanto, condiciones de tampón óptimos pueden extender la salud de las larvas y la longitud de formación de imágenes. Por otra parte, las concentraciones más bajas tricaína se pueden utilizar para la anestesia, o 2-fenoxietanol, que encontramos es bien tolerado durante las fases de larva y adultos a 28 ° C durante al menos 60 horas. Para evitar defectos en la regeneración de la aleta, quitamos la agarosa de la aleta de la cola antes de la imagen. Nuestros datos muestran que dentro de 1,5 días la aleta se ha regenerado a aproximadamente 60%. Esta tasa de regeneración es consistente con un estudio anterior definición de 3 días unas un tiempo promedio para la regeneración de la aleta caudal en larvas de pez cebra hasta 6 dpf 16. Métodos alternativos a la agarosa sin embargo se podrían utilizar para montar el pescado para formación de imágenes. Por ejemplo, plasma delgada coagula 31 o etileno propileno fluorado (FEP) tubos recubiertos con metilcelulosa y llenos de concentraciones muy bajas de agarosa (0,1%) han sido recomendados para la hoja de microscopía de luz 32 y puede ser adecuado para nuestro método presentado. Sin embargo, no recomendamos metilcelulosa y 0,1% de agarosa, ya que requieren que la muestra se montan en la parte inferior de la cámara debido a la falta de solidificación de estos medios. Concentraciones muy altas de metilcelulosa generarán además de bolsas de aire en base a nuestra experiencia, y éstos pueden interferir con el procedimiento de imagen. Si se prefieren estos medios con el uso de la cámara inferior, es importante que una distancia de trabajo adecuada entre la lente objetivo y la muestra está presente. Cabe señalar que mSe recomienda etilcelulosa como un medio de montaje sólo para un máximo de 1 día, ya que puede interferir con la salud larval 32. Montaje de la muestra en la tapa puede dar lugar a una deriva hacia abajo gravitacional lento. Por lo tanto, se recomienda imagen múltiples secciones en cada punto de tiempo, que, o bien se puede proyectar en un solo plano o sólo las imágenes que se encuentran en el plano focal puede ser extraído para el montaje de la película final. Imágenes de la muestra en la cámara inferior podría ser una metodología alternativa para evitar la posibilidad de deriva hacia abajo. Coágulos de plasma podrían ser útiles para evitar la deriva, ya que el plasma se adhieren a la capa envolvente exterior (EVL, peridermis) 31 y por lo tanto puede estabilizar la muestra. Sin embargo, esto tiene que ser probado, así como cuánto tiempo larvas de pez cebra se puede mantener en coágulos de plasma sin interferir con la salud larval o regeneración de aleta. Nuestra película fue ensamblada utilizando secciones individuales (26 micras)de un z-pila grabada, que cubría todo el espesor de la aleta (~ 10 micras) y que representó el potencial z de la deriva de la aleta durante el procedimiento de formación de imágenes. Con el fin de conservar la información en 3-D, también es posible z-pilas en imágenes solo proyecto. Debido a que esto puede resultar en el efecto borroso de la imagen, la deconvolución de campo claro puede ser deseable. Software, tales como deconvoluir o X3 AutoQuant podría ser utilizado para este propósito. Alternativamente, los algoritmos matemáticos (descritos en Tadrous 33) se pueden aplicar para la obtención de una función de punto-propagación de alta relación señal a ruido (SNR). La obtención de una alta SNR representa uno de los principales obstáculos en la deconvolución campo claro. Aunque este método requiere un alto contraste y espesor de la muestra fina, que sería apropiado para la imagen de la aleta de la cola debido a su anchura reducida. Una clara ventaja del método de formación de imágenes que se presenta es que es rápidamente adaptable a cualquier microscopio estereoscópico equipado con un una cámara CCDd software de lapso de tiempo y ofrece una alternativa de bajo costo a los sistemas de imagen confocal más caros. Si bien este método no utiliza la fluorescencia para la detección de células, que se puede extender para tales aplicaciones mediante la utilización de un sistema automatizado de control de persianas y post-imagen de software de deconvolución 34. Esto permitiría a los usuarios observar aún más los procesos de reparación de heridas y la regeneración con una sola célula o resolución subcelular durante períodos de tiempo más largos. La claridad óptica y la facilidad con la que embrionario y larvas de pez cebra se pueden manejar, y la capacidad de adaptación de este método para cualquier microscopio estereoscópico hace adecuado para la enseñanza de la biología básica de vertebrados en un salón de clases. Este método puede proporcionar a los estudiantes una mejor comprensión de los procesos biológicos básicos que subyacen en la reparación y regeneración de tejidos. Otros procesos biológicos que han sido capturadas con un método similar son el desarrollo embrionario del pez cebra 23,34 y cardiacafunción (no publicado). Este método también ofrece la posibilidad de que la reparación de monitoreo de la herida y la regeneración en las larvas que han sido manipulados genéticamente y farmacológicamente.

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48&#34; (Home Depot)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW CORNING&#174; HIGH VACUUM GREASE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipette tips 20 &#181;l (Eppendorf, Cat. No. 930001007)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe&#160;(BD, Cat. No. 309657)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Luer-Lok&#8482; disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Discovery.V12 compound microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Plan Apo S 3.5X objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

La técnica presentada es adecuada para dilucidar la dinámica de reparación de tejidos en respuesta a la amputación. La película demuestra que la amputación de la aleta provoca inicialmente un efecto en bolsa de tabaco, que se caracteriza por contracciones a través de cables de actina-miosina que están presentes en la aleta 28 veces (Figura 5 A, B). Al mismo tiempo, las células se extruyen de la herida (véase la película). La contracción puede ser por tanto un medio para expulsar las células que probablemente están destinados a someterse a la muerte celular. Nuestros resultados muestran además que el crecimiento del desarrollo de la larva se produce independientemente de la regeneración (película), mientras que la regeneración de la aleta no inicia hasta la amputación poste sobre 14 horas, medido por longitud de la aleta y el área en el transcurso de tiempo de 36 horas después de la amputación (Figura 5C , D). El crecimiento de la aleta regenerativo total después de 1,5 días era aproximadamente el 60% de la longitud de la aleta original (Figura 5E). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que tr amputación<html> Iggers contracción aleta, extrusión de las células de la herida, y una respuesta regenerativa temporalmente retardada. Mientras que las células extruidos se probablemente destinados a experimentar la muerte celular, la naturaleza de estas células necesita una mayor aclaración. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> Figura 1. Imagen de montaje anillo de la cámara (A) Se muestra un anillo de plástico que está unida a un cubreobjetos con grasa de silicona. Una malla de plástico está fijada en el interior de la cámara con cuatro pequeños puntos de grasa de silicona. (B) La cámara que contiene la larva montada se llena con una solución de tricaína y un portaobjetos de vidrio está unido a la parte superior. (C) Un montado de 2 días de edad larva (flecha) se muestra a mayor aumento para representar su tamaño en relación a la malla.&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> Figura 2. cámara Imaging asamblea hecha de placas de Petri. (A) Se muestra una tapa de cristal placa de Petri con fondo de cristal comercial con una malla de plástico unido a la cubreobjetos de vidrio. (B) Se muestra una cámara de Petri plato de auto-construida con un agujero perforado en la tapa y un cubreobjetos adjunto desde el exterior con grasa de silicona. La malla y la larva se montan dentro de la cámara que contiene la solución tricaína. Para sellar la cámara, grasa de silicona se aplica en el borde superior externo de la cámara inferior y la tapa superior adjunto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Esquema de la amputación y el montaje de una larva para la imagen. (A) Para la amputación, coloque una larva anestesiado sobre una placa de Petri de agarosa-revestido y amputar la aleta de la cola con una aguja de jeringa. (B) Para el montaje, la transferencia de la larva con una pipeta de transferencia en un tubo de 1,5 ml lleno con 42 ° C de agarosa líquida y la pipeta una gota que contiene la larva en la cámara de formación de imágenes, orientar el pescado y cubrir el solidificado de agarosa con medio de embrión. (C) Raspe la agarosa de la aleta de la cola con una punta de pipeta microloader tapado o herramienta similar y sustituir medio de embriones con medio fresco. (D) La imagen de la aleta de la cola bajo un microscopio estereoscópico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4. cámara de incubación climatizada construida autónomos. (AC) Se muestra una cámara de incubación climatizada hecho de cartón, plástico de burbujas y Velcro. Un calentador cúpula cable (originalmente diseñada para la incubación de huevos de pollo) está unido a la cámara usando cinta de aluminio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> Figura 5. dinámica de regeneración de aleta. (A) Esquema del método de ensayo de la amputación y la cuantificación aleta caudal utilizado para determinar la longitud de la aleta (flecha roja) y el área (contorno rojo de la aleta). (B) de la cola de la aleta amputación activa inicialmente la contracción de la aleta, seguido de Regeconsecuencia tejido nerative. La aleta también experimenta crecimiento del desarrollo, como lo demuestra el aumento de tamaño lateral. (C) se muestra la longitud de la aleta como una función del tiempo, revelando un crecimiento regenerativo de partida lineal a ~ 14 hPa. (D) La cuantificación del área de la aleta revela un descenso inicialmente en tamaño, lo que puede atribuirse a la contracción de la aleta. Después de ~ 14 horas, que aumenta el tamaño de las aletas a una velocidad lineal. (E) La comparación de la longitud de la aleta antes de la amputación y después de 36 horas muestra ~ 60% de crecimiento. Barra de escala: 100 micras Abreviaturas: pre-amplificador, pre-amputación; horas después de la amputación, hpa; regeneración, la regeneración; amplificador, la amputación <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">Película</a> . Fin de regeneración en el transcurso de tiempo de 36h. Se muestra una aleta de la cola de un viejo larva 2,5-día durante el curso de la regeneración. A partir de post amputación 30 min crecimiento regenerativo se forma la imagen en intervalos de 30 minutos en un microscopio estereoscópico utilizando una lente objetivo 3.5x.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K vistas.  MDI Biological Laboratory. We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...