Damos las gracias a Marcos Terasaki para el asesoramiento inicial sobre el uso de un microscopio de dos fotones para crear daño en los tejidos locales, Kathy Joubin para el asesoramiento sobre el montaje de time-lapse, y los laboratorios de Sagasti y Portera-Cailliau para los debates. Los primeros experimentos fueron realizados por AS como becario de la Fundación de hierba en los Laboratorios de Biología Marina en Woods Hole, MA. Trabajar en el laboratorio Sagasti fue apoyado por becas de la Fundación de Whitehall, la Fundación Klingenstein, y Burroughs Wellcome Premio Trayectoria del Fondo en las Ciencias Biológicas.

Parte 1: Montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes <ol><li> Prepare un 1% de baja fusión solución de agarosa para incrustar. Disolver la agarosa en agua desionizada, calentando en el microondas, alícuotas en tubos pequeños y almacenar en un bloque de calentamiento a 42 grados centígrados. </li><li> Seleccionar embriones para la imagen y eliminar sus coriones tirando suavemente del corion además con unas pinzas. Los embriones pueden ser colocados en una solución al 5% PTU timbres en 22-24 horas después de la fecundación (HPF) para inhibir la formación de pigmento. Esto mejora la claridad de la imagen y es esencial para la realización de dos fotones axotomies de los axones sensoriales. Si el pigmento natural se permite a la forma, autofluorescencia oscurece los axones en el microscopio de dos fotones. Timbres solución para el pez cebra contiene 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, y 5 mM HEPES, pH 7,2. </li><li> Anestesiar a los embriones mediante la adición de ~ 0,02% tricaína a los timbres PTU. Hacer que los animales que no son sensibles al tacto antes de proceder. </li><li> Prepare la cámara de imagen a largo plazo mediante la aplicación de grasa de vacío a un lado de un anillo de vidrio o teflón y fijarlo en una hoja de cubierta de vidrio. </li><li> La transferencia de un embrión en los 42 grados solución de agarosa con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no transferir la mayor parte de los timbres PTU, a continuación, transferir el embrión con una gota de agarosa en una hoja de cubierta preparada. </li><li> La posición del embrión como se desee, como la agarosa se endurece. Tenga en cuenta que la cámara de imágenes se volcó cuando se hace para que la hoja de la cubierta será la superficie superior. </li><li> Si usted tiene una platina motorizada y puede localidades de varias imágenes a la vez, repita los pasos 1.4 a 1.6 por cada embrión. </li><li> Deje que la agarosa para solidificar completamente, y luego rellene el ring con tricaína 0,02% Timbres PTU. </li><li> Aplicar grasa de vacío al otro lado del anillo (s), y luego cubrir el anillo (s) con un portaobjetos de vidrio. Voltear la cámara sellada (s) otra vez. Estas cámaras se pueden utilizar para obtener imágenes en los microscopios vertical o invertida. </li></ol> Parte 2: dos fotones usando un axotomía hecha a la medida de dos fotones con un microscopio Chameleon Ti-zafiro láser <ol><li> Prepararse para la imagen. Lugar al embrión montado (s) en un portaobjetos bajo el microscopio. Se centran en un embrión con un objetivo 40X de agua (0,8 NA). Encienda el láser. Hemos sido capaces de visualizar de forma reproducible y daños GFP neuronas que expresan mediante los siguientes parámetros. Para visualizar los axones en una potencia no-perjudicial, establece láser a una longitud de onda de 910 nanómetros (nm) y una potencia de 30 milivatios (mW lista son la cantidad de energía en la muestra). Abra el software de imágenes. Usamos Software scanimage desarrollado en el laboratorio Karel Svoboda es 2, 3. </li><li> Prensa enfoque para analizar el embrión con el láser de dos fotones, localizar el axón desea axotomize, y la captura de una imagen de este axón. Marque las posiciones Z primero y el último, adquirir la imagen, y hacer una proyección máxima de las pilas Z. </li><li> Zoom 70X en la rama del axón desea axotomize y detener la exploración. Aumentar la mW en la muestra del poder dañino de 180 mW, y realizar un análisis simple con el láser. Hacemos esto mediante el establecimiento de la cantidad de cortes de Z a 1 y pulsando &quot;Grab&quot;. Esto debería ser suficiente para romper el axón. Véase la discusión de los métodos para optimizar el procedimiento para su microscopio y el objetivo experimental. </li><li> Reducir, reducir el poder de 30 mW y tomar una imagen. </li></ol> Parte 3: dos fotones axotomía en 510 microscopio confocal Zeiss / dos fotones <ol><li> Lugar montado embrión en el escenario y lo pongo en enfocar con el objetivo 25X de agua o un objetivo adecuado. </li><li> A su vez en el de dos fotones (910 nm) y argón (488 nm) en un entorno multi-pista, así que es posible pasar de uno a otro. Aunque los dos rayos láser se utilizan para detectar las buenas prácticas agrarias, la emisión de dos fotones se visualiza con el rojo, y la emisión de láser de argón con el verde para diferenciar los dos. </li><li> El uso del láser de argón para identificar un axón que se lastimen. En la configuración Z marca las secciones ópticas primera y la última. Toma una imagen confocal y crear una proyección máxima de la pila Z. </li><li> Elija la región del axón que se lesiona y traer a esta región en foco. Apague el láser de argón y encender el láser de dos fotones. Busque en la muestra con el de dos fotones en un láser de intensidad de la transmisión ~ 9% para asegurarse de que el axón se encuentra todavía en el foco. </li><li> Haga clic en el botón &quot;stop&quot; para que la herramienta de recorte estará disponible. El uso de cultivos para ampliar el área de interés. Por lo general, nos acercamos a ~ 70X (zoom se puede comprobar en el &quot;modo&quot; ficha). En virtud de los &quot;canales&quot; pestaña cambiar la intensidad de los dos fotones de la transmisión ~ 9% a la transmisión de un 15-20%. </li><li> Para cortar un axón activar el &quot;XY rápida&quot; botón durante 1 segundo y luego presione el botón de parada para evitar daños en exceso. El axón debe ser visto como escombros esparcidos si el procedimiento funciona. </li><li> Para asegurarse de que el axónfue dañado volver a los 488 nm láser de argón, tome otra imagen confocal, y crear una proyección máxima. </li></ol> Parte 4: Confocal lapso de tiempo de imágenes en Zeiss LSM 510 <ol><li> Prepararse para la imagen. Si está utilizando una etapa de calefacción, asegúrese de que a su vez en al menos 30 minutos antes de la creación de su tiempo de intervalo. Lugar al embrión montado (s) en un portaobjetos bajo el microscopio. Se centran en un embrión con el objetivo de aire deseado. Utilizamos un 20X, 0,5 NA objetivo. Abrir Zeiss LSM 510 imágenes de software. Encienda el láser adecuado y establecer la configuración deseada. A continuación se describe un protocolo detallado para la imagen a largo plazo con el software Zeiss LSM Tiempo Multi. Estos métodos pueden ser adaptados para su uso en su propio microscopio con su software de imagen. </li><li> Definir la posición y la configuración de su primer embrión en la ventana de tiempo múltiples. Abra la exploración, el escenario, y las ventanas de varios tiempos. Activar exploración rápida en la ventana de análisis. Mover el escenario para la posición XY deseado. Marque las posiciones Z primero y el último en la ventana de análisis. Oprima Parar, luego media, también en la ventana de análisis. Espere a que la exploración de la parte media Z hasta el final, a continuación, pulse posición de la marca en la ventana de escenario. Si usted es sólo un embrión de imagen, haga clic en el &quot;Lugar Único&quot; pestaña en la ventana de tiempo múltiples. Haga clic en &quot;Reemplazar XYZ&quot; y luego en &quot;Guardar configuración&quot;. Acuerdo cuando se le pregunta si desea sobrescribir la configuración anterior. Continúe con el paso 4.4. Si usted tiene una fase de mecanizado, se puede configurar múltiples lugares a los embriones de varias imágenes. En este caso, debe seleccionar la opción &quot;varias ubicaciones&quot; ficha antes de definir el XYZ y la configuración para la primera ubicación. Además, asegúrese de que el menú desplegable justo debajo del &quot;varias ubicaciones&quot; ficha está en la posición 1, y que el menú desplegable en la sección de configuración de múltiples dice loc 1, antes de hacer clic en Guardar configuración. </li><li> Definir la posición y la configuración del resto de los embriones en la ventana de tiempo múltiples. Busque su embrión siguiente, a continuación, pulse análisis rápido, mover el escenario en la posición deseada XY y Z marca las posiciones primera y la última en la ventana de análisis. Oprima Parar, luego media, también en la ventana de análisis. Espere a que la exploración de la parte media Z hasta el final, a continuación, pulse posición de la marca en la ventana de escenario. Haga clic en &quot;Reemplazar XYZ&quot;. Compruebe que el menú desplegable justo debajo del &quot;varias ubicaciones&quot; ficha está en el punto 2, y que el menú desplegable en la sección de configuración de múltiples dice loc 2, a continuación, haga clic en &quot;Guardar configuración&quot;. Acuerdo cuando se le pregunta si desea sobrescribir la configuración anterior. Repita este proceso para los embriones sobrantes. </li><li> Establecer los parámetros para la adquisición de la imagen en la ventana de Loc Multi. Elija la opción GR-GL en la &quot;Lista de los bloques&quot; sección, a continuación, introduzca el número deseado de repeticiones grupo. Este es el número de veces que el confocal se obtiene una imagen en cada lugar. Introduzca el intervalo de espera deseado en la sección Parámetros. Esta es la cantidad de tiempo desde el inicio de la repetición de imágenes una al inicio de la siguiente repetición. Seleccione &quot;ZStackXY&quot; en la sección de configuración. Introduzca su nombre de archivo base, en la sección inferior. Haga clic en &quot;DB Seleccionar Imagen&quot; y seleccione su mdb. Haga clic en el botón &quot;Opciones&quot;. Seleccione la carpeta mdb para salvar los archivos temporales. Marque &quot;mantener la imagen final abierto&quot;, &quot;guardar la imagen final&quot;, y &quot;en medio de la pila de z&quot;. Seleccione Intervalo de espera. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana de opciones. Haga clic en &quot;hora de inicio&quot;. Dejar la ventana abierta a la hora Multi duración de la imagen. </li><li> Analizar los datos. Cuando el time-lapse ha terminado, el software Time Multi compila todos los archivos temporales en un archivo de resumen para cada ubicación. Si desea detener la película antes de que finalice, asegúrese de pulsar en &quot;Finalizar&quot; en lugar de &quot;Stop&quot;, de modo que un archivo de resumen se creará. Los archivos temporales y archivos de resumen se guardarán automáticamente en la carpeta designada mdb. En el menú de software LSM, haga clic en &quot;Vista 3D&quot;, luego &quot;Proyección&quot;. Con el archivo de resumen seleccionado en el menú desplegable, haga clic en &quot;Aceptar&quot;. Esto va a generar proyecciones de máxima de la pila de Z para cada imagen confocal. En el menú de software LSM, haga clic en &quot;Archivo&quot;, luego &quot;Exportar&quot;. Guardar las proyecciones de máxima como una serie de archivos tif. A continuación, puede crear una película de la serie de archivos tif utilizando ImageJ o QuickTime Pro.. Los axones de las imágenes LSM se puede rastrear en tres dimensiones utilizando el software de análisis de imagen (por ejemplo, Neurolucida de MicroBrightfield) para generar información cuantitativa detallada sobre la morfología del axón. </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos Una experiencia exitosa se traducirá en una representación exacta de la dinámica celulars de la recuperación de una lesión axonal. Los embriones serán sanos después de la filmación, sin degeneración visible y latidos fuertes del corazón. La axotomía debería producir daños precisos, sólo cortar la rama definida del axón. No debe haber ningún daño a los axones los alrededores y la muerte celular mínima. Creemos que ver la muerte de una sola célula epidérmica directamente sobre el sitio de axotomía en ~ 50% de los experimentos. Si se observa más daño, debe optimizar sus dos fotones protocolo como se describe en la discusión.

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Hemos utilizado los métodos descritos a axotomize precisamente periférico los axones sensoriales y de observar directamente la regeneración en el embrión de pez cebra de vida. A largo plazo de lapso de tiempo de imagen confocal en el pez cebra puede ser utilizado para observar muchos procesos de desarrollo en vivo. El procedimiento de axotomía de dos fotones descritos podrán ser modificados para muchos de los objetivos experimentales. Hemos utilizado el mismo procedimiento general para la ablación de los...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Pez cebra han sido utilizados para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo de time-lapse del embrión transparente de vida. Aquí se describe un método para montar embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes y se muestra cómo automatizar la captura de imágenes con lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal. También describe un método para crear daño controlado y preciso a las distintas ramas de los axones sensoriales periféricas en el pez cebra con el poder concentrado de un láser de femtosegundo montada en un microscopio de dos fotones. Los parámetros para el éxito de dos fotones axotomía debe ser optimizado para cada microscopio. Vamos a demostrar de dos fotones axotomía en tanto a la medida de dos fotones microscopio Zeiss y un 510 / confocal de dos fotones que son dos ejemplos. Pez cebra neuronas sensoriales del trigémino se pueden visualizar en una línea transgénica que expresa GFP dirigida por un promotor neuronas sensoriales específicas 1. Hemos adaptado este modelo de pez cebra trigémino de observar directamente la regeneración de axones sensoriales en vida embriones de pez cebra. Los embriones son anestesiados con tricaína y colocado dentro de una gota de agarosa al solidificarse. Embriones inmovilizados están sellados dentro de una cámara de imágenes llenas de feniltiourea (PTU) Timbres. Hemos encontrado que los embriones pueden ser continuamente imágenes de estas cámaras durante 12-48 horas. Una imagen confocal solo es capturado para determinar el sitio deseado de axotomía. La región de interés se encuentra en el microscopio de dos fotones de imágenes de los axones sensoriales en baja, no dañar el poder. Después de hacer zoom sobre el sitio deseado de axotomía, el poder es mayor y una sola exploración de esa región definida es suficiente para romper el axón. Ubicación de múltiples imágenes a intervalos de tiempo-luego se estableció en un microscopio confocal de observar directamente la recuperación de una lesión axonal.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  University of California, Los Angeles. Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

Video: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Investigación

Biología

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...