Se agradece a Genia Brodsky de la figura de gráficos, Vyacheslav Kalchenko, Lutz Douglas, y Leonid Roitman de asesoramiento y asistencia técnica con el uncaging de dos fotones, Maayan Tahor y Suliman Elsadin de asistencia técnica; Uwe Strähle por la amabilidad de ofrecer la línea de reportero y neurogenin1 Amos Gutnick a los comentarios de este manuscrito. La investigación en el laboratorio Levkowitz con el apoyo de la Fundación alemana-israelí (el número de concesión 183/2007), Israel Science Foundation (subvención número 928/08) y la Harriet y Marcel Dekker Fundación. GL es un titular de la Cátedra de Desarrollo Tauro carrera en la investigación biomédica.

Se describe un protocolo de marcado de células con fluoresceína en jaulas, sin embargo, otra foto activable por los tintes y las proteínas también se puede utilizar. 1. La inyección de fluoresceína Caged <ol><li> Prepare solución al 5% de acciones (5 mg enjaulado-fluoresceína / 100 KCl 0,2 M l) de dextrano conjugado con 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) enjaulados fluoresceína (10.000 MW dextrano, aniónicos, Invitrogen, sondas moleculares, Carlsbad, CA , cat.. D-3310). Alícuota y almacenar a -20 ° C. Tenga en cuenta que DMNB-jaula con fluoresceína es sensible a la luz y se debe mantener en la oscuridad. </li><li> Prepare una cubeta de inyección hechos de agarosa al 1% (Sigma, St. Louis, MO, cat.. A9539) como se describe en &quot;El libro de pez cebra&quot; 1. </li><li> Preparar 2 litros de medio E3 mediante la dilución de una solución de 100 x acciones E3. </li><li> En la noche antes de la inyección, preparar las jaulas de apareamiento que separa el hombre (s) de la hembra (s) de la línea deseada transgénicos que expresan un punto de referencia visible fluorescente (GFP, RFP, etc) que se utiliza para localizar las células diana para la fotoactivación. </li><li> Prepare las agujas de inyección capilar (pared delgada capilares de vidrio de filamento, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, cat.. TW100F-6) con un extractor micropipeta (Instrumento Sutter, Novato, CA, P-97). </li><li> Descongelar una alícuota de 5% enjaulados fluoresceína en el hielo. </li><li> Diluir la solución al 5% enjaulados acciones de fluoresceína en KCl 0,2 M a una concentración final de 1%, y mantener en hielo. Evitar la exposición a la luz. </li><li> Apareamiento de configuración cruza preparado en el paso 4. </li><li> Recoge los huevos fertilizados en cuanto se establecen. Orientar de una célula de embriones etapa en el molde de inyección de agarosa recubierta de un E3. </li><li> Con una punta de microloader (Eppendorf, Hamburgo, Alemania, cat.. 5242 956.003) relleno de una aguja de inyección con aproximadamente 1 l de 1% enjaulados solución de fluoresceína. </li><li> Lugar cargado de aguja en un micromanipulador unido a una gasolina microinyector (neumático picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820). </li><li> Ajustar el volumen de inyección de 2-3NL e inyectar la jaula-fluoresceína directamente en el citoplasma de la célula. Inyectar un mínimo de 50 embriones por experimento. </li><li> Incubar los embriones en la oscuridad a 28,5 ° C en el E3 a la etapa de desarrollo deseado. Si los embriones de más de 24 horas después de la fecundación se analizan, añadir 0,1% feniltiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat.. 22290-9) para inhibir la pigmentación. </li></ol> 2. Embrión de montaje <ol><li> Prepare una solución fresca E2 (véase la parte de soluciones, se pueden almacenar a 4 ° C durante una semana). </li><li> Una capa de 60 mm cajas de Petri con una fina capa de agarosa al 1% disuelta en medio de E2. </li><li> Prepare 2% bajo punto de fusión de agarosa (Ultra Pure LMP agarosa, Invitrogen, Carlsbad, CA, el gato no 16520100..) Para incrustar: disolver la agarosa en agua destilada estéril doble por calentamiento por microondas hasta que hierva. Mantenga la tapa del tubo está abierto durante el calentamiento. Alícuota de 1 ml en tubos de microcentrífuga y mantenerse en un bloque de calentamiento a 72 º C. </li><li> Retire el corion de los embriones tirando suavemente del corion además con unas pinzas cortantes (No. 5). Mantener los embriones en la solución de E2 en un plato de agar-revestido (ver paso 2). Dechorionated embriones deben ser manejados con fuego pulido pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno. Evite la exposición del embrión dechorionized a la atmósfera, estos embriones podrían ser dañados por la tensión superficial de líquidos. </li><li> Recoge los embriones seleccionados en un pequeño volumen de E2 con un fuego cristal pulido pipeta Pasteur, y el lugar en el embrión de 60 mm placa de Petri. Monte una gota (~ 150 l) de agarosa al 2% (paso 3) al lado del embrión. Rápidamente mezclar las dos gotas de obtener una homogeneidad final de ~ 1% de agarosa y se mezcla con un microscopio de disección orientar el embrión con la cara dorsal frente a la lente del objetivo. </li><li> Espere hasta que la agarosa se ha solidificado y se añade medio de E2 hasta que el embrión embebido está sumergido en un líquido. Es preferible obtener un solo embrión por placa, ya que puede ser liberado de la agarosa después de que el proceso de fotoactivación. </li></ol> 3. Fotoactivación <ol><li> Utilizamos un Zeiss LSM 510 META NLO de dos fotones microscopio equipado con una banda ancha ajustable (700 1020nm) Mai Tai-HP-láser de femtosegundos de Spectraphysics. </li><li> Lugar al embrión montado en un soporte de la placa bajo el microscopio. La señal fluorescente en el embrión se visualiza usando 40x/0.8W agua Achroplan inmersos objetivo. Para los siguientes pasos que utilizamos no descanned detector (NDD) con filtro de paso de banda (BP) de 500-550nm. </li><li> Como requisito previo para el proceso de fotoactivación, obtener información espacial fluorescente de la región de interés mediante la adquisición de una serie de imágenes de la más ventral a la parte dorsal de la señal detectada fluorescente con dos fotones de longitud de onda del láser de 860nm (para la detección de buenas prácticas agrarias). Con este fin, la resolución se puede obtener suficiente con un período de 6μm entre cada plano focal adquirido. </li><li> Seleccione el destinoplano z para la fotoactivación y traer a esta región en foco. Dependiendo del propósito del experimento, la región de interés puede realizarse dentro o fuera de la señal GFP visible. Tomar una imagen en este plano-z. Guardar la imagen y mantenerla abierta en una ventana separada. </li><li> La longitud de onda de láser de dos fotones de 720nm y cuando el láser está en modo bloqueado abrir el &#39;Editar blanqueo &quot;del menú. Definir la región de interés (ROI) para la fotoactivación de acuerdo con la imagen tomada en 860nm (paso 4) utilizando el menú &quot;Definir la Región&quot;. Es crucial seleccionar el retorno de la inversión en esta imagen después de cambiar la longitud de onda de láser de 720nm, como la acción de este último cambia la x, y las posiciones del campo observado. </li><li> Ajustar los siguientes parámetros para la fotoactivación en el menú &quot;Edición lejía&quot; (ver paso 9): un poder) láser relativa, b) número de iteraciones, c) la velocidad de escaneo. </li><li> &#39;Bleach&#39; de prensa en la ventana &quot;Editar lejía&quot; y esperar hasta que deje de láser. </li><li> Volver a 860nm, adquirir una imagen de un solo plano para evaluar la intensidad de los materiales que le correspondan fotoactivado y una segunda serie de la adquisición de imágenes para evaluar la Z-span (espesor) del dominio activado. </li><li> Considere los siguientes parámetros para la fotoactivación: <ol class="lalpha"><li> Una forma empírica debe determinar las condiciones óptimas para la fotoactivación variando dos parámetros: la intensidad del láser y la duración de la fotoactivación. La potencia del láser relativa puede ser controlado por el acústico-óptica modulador (OMA) de transmisión. La duración de la foto-es una función del número de iteraciones y la velocidad de escaneo. </li><li> Determinar el rango lineal de la intensidad de fluorescencia con el fin de evitar la saturación de la fluorescencia uncaged. </li><li> Existe una correlación lineal entre la intensidad de fluorescencia obtenida de las moléculas uncaged y la duración del eje z de el clon fotoactivado 2. </li></ol></li></ol> 4. La detección de la fluoresceína Uncaged <ol><li> Después de fotoactivación, aumentar los embriones en la oscuridad a 28,5 ° C en medio de E2 contiene 0,1% de PTU para prevenir la aparición de la pigmentación de la piel. </li><li> En la etapa de desarrollo deseado, extraer el embrión de la agarosa con un microscopio de disección. El uso de un bisturí señaló, crear una &quot;V&quot; en la incisión en forma de agarosa cerca del embrión, de manera que la &quot;V&quot; está apuntando hacia la cabeza del embrión. Coloque una pinza cerrada en el momento de la &quot;V&quot; cerca de la cabeza del embrión y empuje suavemente abra la pinza que separa la agarosa a lo largo de la longitud del embrión y la liberación del embrión en el medio. </li><li> Recoger los embriones con una pipeta Pasteur pulida al fuego y fijar con paraformaldehído (PFA, 4% en 1 x PBS, pH 7,2) ya sea para 3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Retire la solución de fijación y enjuague 2-3 veces en PBST durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavado de embriones con el 100% de metanol durante 10 minutos, añada el metanol fresco y se incuba a 20 ° C durante al menos 2 horas. </li><li> Rehidratar embriones por incubaciones sucesivas (5 minutos cada uno) en una serie de metanol diluido en PBSTr: 80%, 60%, 40% y 20%. Lavado de 2 x 10 minutos en PBSTr. </li><li> Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en 500 l de solución de bloqueo. </li><li> Añadir un anti-fosfatasa alcalina fluoresceína (AP) Los fragmentos Fab (Roche, Palo Alto, CA, cat.. 11426338910), diluido 1:500 en solución de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C (tubos de microcentrífuga a cabo en sus lados) . </li><li> Lavado de 5 x 15 minutos en PBST. </li><li> Lavar durante 5 minutos en 0,2 M de NaCl en TNT. </li><li> Lavar durante 5 minutos en 0,4 M de NaCl en TNT. </li><li> Equilibre 3 x 5 minutos en una solución recién preparada Prestain. </li><li> Disuelva una tableta de rápida Red (Roche, Palo Alto, CA, cat.. 11496549001) en 2 ml de solución Prestain. Se recomienda filtrar la solución utilizando papel Whatman N º 2 para omitir sin disolver las partículas. Por otra parte, la desaceleración de soluciones y utilizar el líquido sobrenadante claro. </li><li> Añadir 500 l solución Fast Red a cada tubo, se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente y el desarrollo del color del monitor hasta que aparezca la señal de fondo proporción se alcanza (20 minutos a varias horas). Si el fondo se desarrolla, la transferencia a 4 ° C. Después de una hora de incubación, añada una nueva solución rápida coloración roja. </li><li> Detener la reacción de tinción de 3 x 5 minutos lavados en PBST. </li><li> Fijar durante 20 minutos en PFA al 4% a temperatura ambiente. </li><li> Lavado de 2 x 5 minutos en PBST. </li><li> Embriones claro a través de una serie de 25%, 50% y 75% de glicerol en PBS hasta que los embriones se establecieron en la parte inferior del tubo. Los embriones pueden ser almacenados a 4 ° C durante unos días. </li></ol> 5. La visualización fluorescente de la zona Uncaged <ol><li> Preparar un portaobjetos de microscopio para el montaje: el uso de una jeringa de 1 ml se aplican cuatro manchas de grasa de silicona transparente en la diapositiva, colocado a una distancia de unos 15 mm uno del otro. Monte el embrión en el Center en ~ 200 l de 75% de glicerol y colocar un cubreobjetos (n º 0; 18x18mm) en la parte superior y empuje suavemente contra la silicona hasta que la solución de glicerol ocupa la superficie entre las diapositivas. </li><li> Lugar al embrión montado en el escenario y lo pongo en foco con un objetivo de 40x. Adquirir una confocal Z-serie de imágenes con 488nm de argón y láser HeNe 543nm como la fuente de excitación. </li><li> El período de eje-z del dominio photoactivatated pueden ser analizadas utilizando la reconstrucción en 3D del embrión uncaged utilizando un software de análisis de imágenes. </li></ol> 6. Soluciones <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174 mm de NaCl, KCl 21 mm, 12 mm MgSO4, 18 mm de Ca (NO3), 15 mM HEPES, pH = 7,4. Esterilice por filtración y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20 mM de CaCl2 * 2HOH, 20 mM MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 mm, Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrado y almacenamiento a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Diluir 20 x E2 con agua destilada y añada recién hechos NaHCO 3 (a la concentración final de 0,7 mm), penicilina y estreptomicina (solución diluida de estreptococos pluma para una concentración final de 1 x que contiene 100 U de penicilina y estreptomicina 100 mg por ml (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat.. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% de Tween-20 en PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> 0,3% de Triton en PBS </td></tr><tr><td> Solución de bloqueo </td><td> 10% de BSA, 0,3% Tritón, DMSO al 1% en PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% de Tween-20 con agua destilada </td></tr><tr><td> Prestain solución </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,4 M NaCl, 0,1% de Tween-20 con agua destilada </td></tr></tbody></table> 7. Resultados representante Un ejemplo de la utilización de la microscopía de dos fotones de photoactivate agentes en un embrión de pez cebra de vida se presenta. Utilizando un enfoque similar que ya trazó el linaje de los fotoactivado etiquetados progenitores neurales en el cerebro del pez cebra 2,3. La figura 1 muestra fotoactivación de un colorante marcador fluoresceína conjugado enjaulados en la placa anterior neural de los embriones de pez cebra que lleva un neurog1:: GFP reportero transgén, que sirvió como un punto de referencia intrínseco en vivo. Los embriones fueron inyectados con fluoresceína enjaulados en la etapa de célula y embebidas en agarosa en fase de capullo. A los 3 - 5-somite etapa de las coordenadas espaciales se midieron en el neurog1:: GFP embriones transgénicos para determinar la región de interés (ROI) para uncaging (Figura 1 A, A &#39;). Nos uncaged el marcador linaje de fluoresceína en un dominio específico de la placa neural (fig. 1B, B &#39;). Posteriormente, el destino de este subdominio dado etiquetados progenitoras neurales se determinó en prim5 (24 horas después de la fecundación), etapa por inmunotinción de la uncaged fluoresceína (Figura 1 C, C &#39;). La extensión de dos fotones uncaging láser, es decir, la intensidad de la fluorescencia uncaged y el espesor del dominio fotoactivado (z-span), se puede controlar mediante el ajuste de dos parámetros: la intensidad del láser y la duración. Este último puede ser controlado por el ajuste del número de iteración y la velocidad del análisis (véase la parte 3, el paso 9; Russek-Blum, 2009). En el ejemplo que se muestra en la Figura 1, se utilizó la potencia del láser con respecto de la transmisión de la OMA 12%, 20 repeticiones y velocidad de escaneado de 25,6 mseg / pixel. El uso de estos parámetros nos etiquetado como un retorno de la inversión que contiene las células y un 10.9 fotoactivado z útil de 30μm (~ 1-2 hileras de células). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un resultado Representante de fotoactivación de fluoresceína enjaulado en embrión de pez cebra en vivo utilizando microscopía de dos fotones. Representación esquemática (AC) y las imágenes representativas (A&#39;-C &#39;) del proceso de fotoactivación. Vivir embrión de pez cebra (A, A &#39;) que expresa GFP bajo el control de neurogenina-1 promotor (neurog1:: GFP), que fue inyectado con jaula fluoresceína trazador en la fase de la celda 1. En el 3-5 - somite etapa, un área discreta del primordio del cerebro anterior (diencéfalo) fue fotoactivado y el uncaged fluoresceína trazador de tinta puede ser detectado (B, B &#39;). Después del procedimiento fotoactivación, el embrión se incuba a 28,5 º C y las células cerebrales que contienen la fluoresceína uncaged fueron rastreadas por los anti-fluoresceína inmunotinción a 24 horas después de la fecundación (HPF, C, C &#39;). Dien, Diencéfalo;. Tel, telencéfalo..

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Foto activable compuestos son moléculas cuya función es enmascarados hasta que se ilumina con una longitud de onda específica (generalmente UV), que induce una reacción fotoquímica que convierte las moléculas en un estado biológicamente o químicamente activos. Estas sondas proporcionan herramientas muy poderosas en la investigación de biología celular, ya que la activación puede ser controlada con precisión temporal y espacialmente, al limitar su exposición a la luz. La ventaja ...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

La fotoactivación de compuestos de interés en un organismo vivo ha demostrado ser un enfoque valioso para investigar diversos procesos biológicos como el desarrollo embrionario, la señalización celular y la fisiología del adulto. En este sentido, el uso de multi-fotón microscopio permite fotoactivación cuantitativa de un determinado agente de la luz sólo responde en los tejidos profundos en una resolución única célula. Como embriones de pez cebra son ópticamente transparente, su desarrollo puede ser monitoreado en vivo. Estas características hacen que el pez cebra un organismo modelo ideal para el control de la actividad de una variedad de agentes químicos y proteínas de la luz enfocada. A continuación se describe el uso de la microscopía de dos fotones para inducir la activación de la jaula químicamente con fluoresceína, que a su vez nos permite seguir el destino de células en embriones de pez cebra en vivo. Nosotros usamos embriones expresar un punto de referencia en vivo genética (GFP) para localizar y orientar con precisión la presencia de células de interés. Este procedimiento también se puede utilizar para la activación inducida por la luz precisa de proteínas, hormonas, moléculas pequeñas y otros compuestos enjaulados.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K vistas.  Weizmann Institute of Science. Microscopía multifotónica permite el control de fotones de baja energía con una penetración profunda óptica y fototoxicidad reducido. Se describe el uso de esta tecnología para el etiquetado de células vivas en embriones de pez cebra. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la foto-inducción de varias moléculas que responden a la luz.

Video: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...