Para aislar las mitocondrias, coloque a la rata decapitada anestesiada en posición prona sobre el hielo. Después de exponer el corazón, corte la aorta aproximadamente de cuatro a seis milímetros por encima de la raíz aórtica y por debajo de los puntos de ramificación carotídea. Cánula la aorta y perfundir el corazón con una solución helada de cardioplejia utilizando una cabeza de presión dependiente de la gravedad hasta que las arterias coronarias se limpien de sangre y el órgano parezca blanqueado.
Diseccionar las aurículas, el tejido valvular cartilaginoso y los tejidos grasos para aislar el miocardio ventricular. Pica el tejido con unas tijeras quirúrgicas afiladas hasta que los trozos tengan aproximadamente un milímetro cúbico. Transfiera el tejido picado al tubo de centrífuga preenfriado, etiquetado como espines uno y dos que contiene la solución de proteasa.
Agregue tampón de aislamiento helado hasta un volumen final de 25 mililitros. Usando un homogeneizador de estator de rotor manual motorizado, disperse el tejido a 18.000 RPM en hielo durante 20 a 25 segundos. Centrifugar el tejido homogeneizado a 8.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Y enjuague suavemente el pellet con cinco mililitros de tampón de aislamiento para eliminar la proteasa residual. Después de desechar el enjuague, agregue tampón de aislamiento helado hasta un volumen final de 25 mililitros.
A continuación, vórtice para volver a suspender el pellet. Centrifugar el tejido homogeneizado a 800 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Vierta suavemente el sobrenadante que contiene mitocondrias en un tubo de 50 mililitros preenfriado etiquetado.
Ahora centrifugar el sobrenadante a 8.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y conserve el pellet que contiene mitocondrias. Con una toallita sin pelusa, absorba el exceso de sobrenadante de la pared interior del tubo sin alterar el pellet y coloque el tubo en hielo.
Agregue 80 microlitros de tampón de aislamiento helado al fondo del tubo y resuelva suavemente las mitocondrias con una micropipeta. Una vez resuspendidas, transfiera las mitocondrias a un tubo de microcentrífuga marcado previamente enfriado. Determine la concentración de proteínas mitocondriales utilizando el ensayo de proteínas de ácido cinético de bisonte.
En un tubo de microcentrífuga preenfriado, diluya el stock mitocondrial hasta la concentración de trabajo deseada con un tampón de aislamiento. Para probar la viabilidad y la calidad de los aislados mitocondriales, cargue 2,3 mililitros de tampón de respiración en las cámaras Oxygraph. Deje que la señal de consumo de oxígeno se equilibre a 37 grados centígrados durante unos 10 minutos o hasta que la tasa esté cerca de cero.
Tras el equilibrio, empuje hacia abajo los tapones y aspire el exceso de tampón. Con una jeringa Hamilton de 10 microlitros, agregue un milimolar de EGTA para quelar cualquier calcio residual en el tampón de respiración en el Oxygraph. Para alimentar la respiración, agregue cinco milimolares de piruvato de sodio y un milimolar de al-malato en el tampón.
A continuación, añada un bolo de mitocondrias diluidas y permita que se respire durante cinco minutos. A los cinco minutos, agregue un bolo de 500 micromolares ADP para iniciar la respiración en el estado tres. Para calcular la relación de control respiratorio, divida la tasa máxima de consumo de oxígeno durante el estado tres por la tasa de consumo de oxígeno justo antes de la adición de ADP en el estado dos.
Se observó un rápido aumento en el consumo de oxígeno inmediatamente después de la adición de ADP, lo que indica un inicio exitoso de la fosforilación oxidativa en mitocondrias cardíacas aisladas. Las mitocondrias cardíacas de conejillos de indias, ratas Sprague-Dawley y ratones Friend con el virus de la leucemia B demostraron altas proporciones de control respiratorio, lo que indica una buena calidad de aislamiento mitocondrial. Las mitocondrias hepáticas y renales de las ratas Sprague-Dawley también mostraron proporciones aceptables de control respiratorio que respaldan el aislamiento exitoso.
Las células HEK293 exhibieron valores de índice de control respiratorio por encima del umbral aceptable, lo que confirma la calidad del aislamiento mitocondrial de estas células.
