Para empezar, tome células U2OS cultivadas con una confluencia del 60% al 70% y divídalas utilizando 0,25% de tripsina-EDTA. Prepare placas de 60 milímetros agregando cubreobjetos redondos de 13 milímetros. Placa de 400.000 celdas en una placa de 60 milímetros que contiene múltiples cubreobjetos redondos de 13 milímetros.
Luego, retire el medio de cultivo de las placas. Añadir medio de cultivo que contenga 25 micromolares de etopósido e incubar las células durante 20 minutos, 1 hora y 3 horas. Después de la incubación, retire el medio de las placas.
Lave las células con PBS tres veces. Para fijar las celdas, agregue metanol helado en volumen suficiente para cubrir la superficie del cubreobjetos e incube durante 10 minutos a 20 grados centígrados. A continuación, lave las fundas con PBS tres veces y transfiéralas a una cámara de humedad.
Después de extraer el PBS, agregue de 30 a 40 microlitros de tampón de permeabilización e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lave las fundas tres veces con PBS. A continuación, desconecte el PBS de las muestras.
Agregue de 30 a 40 microlitros de la solución de bloqueo provista en el kit de PLA a cada cubreobjetos. Incubar la placa en una cámara de humedad precalentada a 37 grados centígrados durante 1 hora. Ahora diluya los anticuerpos primarios en el diluyente de anticuerpos provisto en el kit.
Después de retirar la solución de bloqueo, agregue la solución de anticuerpos primarios a cada cubreobjetos e incube a cuatro grados centígrados durante la noche en una cámara de humedad. Diluya las sondas menos y más del uno al cinco en el diluyente de anticuerpos. Utilice combinaciones como Donkey anti-Mouse MINUS con Donkey anti-Goat PLUS y Donkey anti-Mouse MINUS con Donkey anti-Rabbit PLUS.
Ahora, retira la solución de anticuerpos primarios y lávate una vez con TBST. Después de retirar el exceso de TBST, agregue 20 microlitros de la solución de sonda PLA a los cubreobjetos. Luego, incube en la cámara de humedad precalentada a 37 grados centígrados durante 1 hora.
Diluya el tampón de ligadura 5x en agua de alta pureza. Retire la solución de la sonda PLA y lávela una vez con TBST. Ahora, agregue ligasa a la solución de ligadura con una dilución de 1:40 inmediatamente antes de aplicarla a las muestras.
Incubar en la cámara de humedad precalentada a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, diluya el tampón de amplificación 5x en agua de alta pureza. Una vez que se haya retirado la solución de ligadura de las muestras, lávelas una vez con TBST.
Añadir la polimerasa a la solución de amplificación a diluciones 1:80 inmediatamente antes de aplicarla a las muestras. Incubar en la cámara de humedad precalentada a 37 grados centígrados durante 100 minutos. Golpee el tampón de amplificación, luego lave dos veces con tampón SSC durante 10 minutos cada uno.
Después de lavar las muestras dos veces con PBS, agregue la solución de anticuerpos primarios a cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 1 hora. Al final de la incubación, retire la solución de anticuerpos primarios y lávese tres veces con TBST. A continuación, añada la solución de anticuerpos secundarios a cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Después, lave cinco veces con TBST, dos veces con tampón SSC y dos veces con tampón SSC 0.01x. Finalmente, adquiera imágenes de diferentes pozos o regiones de deslizamientos de cobertura para evitar artefactos debido a una incubación no homogénea, y guarde todos los canales con el mismo patrón de nombre.
