Después de realizar la adquisición de puntos PLA para localizar la interacción de proteínas, abra imágenes de diferentes condiciones para ajustar los parámetros para el análisis en ImageJ. Determine y especifique estos parámetros junto con los datos en el programa de macros. Para eliminar el fondo, haga clic en Procesar y restar fondo.
Utilice la función de vista previa para probar diferentes radios de bola rodante. Para eliminar ruido, haga clic en Proceso, Ruido y Eliminación de manchas. A continuación, haga clic en Procesar y suavizar en el menú del núcleo para aplicar la función de suavizado y mejorar el llenado.
Ahora, haga clic en Imagen, luego en Tipo y seleccione 8 bits para convertirla en una imagen de 8 bits. Después de eso, ajuste el umbral yendo a Imagen, Ajustar y, finalmente, Umbral. Ajuste el umbral para visualizar todos los núcleos o puntos de la imagen, evitando la sobresaturación y el colapso de estructuras.
Además, anote los valores y la prueba en diferentes imágenes. Para convertirla en una máscara, haga clic en Proceso, Binario y Convertir en máscara. Para el núcleo, haga clic en Proceso, Binario y Rellenar agujeros, seguido de Proceso, Binario y Cuenca hidrográfica.
En los puntos PLA, haga clic en Proceso, Binario y Cuenca hidrográfica. Para contar los núcleos, mida el área o la longitud de los diferentes núcleos para estimar el tamaño promedio. Utilice un valor aproximado para analizar partículas haciendo clic en Analizar y Analizar partículas.
Establezca el tamaño en 15 infinito y marque las opciones. Mostrar máscara, mostrar resultados, borrar resultados, agregar al administrador y excluir en los bordes. Para contar los puntos de PLA, mida su área o radio para estimar su tamaño promedio.
Para cada ROI en el administrador de ROI, haga clic en Analizar y Analizar partículas. Establezca el tamaño de 0.02 a 3. Marque las opciones, mostrar máscara, mostrar resultados, borrar resultados, resumir y excluir en los bordes.
Guarde los resultados que muestran el número de puntos por núcleo en cada núcleo presente en la imagen. La interacción de Nek4 Ku70 aumentó en el núcleo después del daño en el ADN después de 20 minutos, una hora y tres horas de tratamiento con etopósido en comparación con las células de control y tratadas con DMSO. El tratamiento con etopósido aumentó significativamente la interacción de la topoisomerasa 2-beta de Nek5 en comparación con el control de DMSO.
La tinción con gamma-H2AX aumentó después de 20 minutos de tratamiento con etopósido y permaneció elevada hasta tres horas, lo que indica una respuesta sostenida al daño del ADN.
