La inmunofluorescencia indirecta permite detectar proteínas de reparación del ADN, fotos de reclutamiento espacial y temporal y ayuda a interrogar las interacciones de Proteinprotein en el sitio del daño del ADN. Después del daño del ADN, las proteínas de reparación del ADN se reclutan para el insulto del ADN mientras que su concentración aumenta localmente, y forman grupos llamados focos que pueden ser visualizados por inmunofluorescencia indirecta en muestras fijas. Esta técnica se puede utilizar para detectar focos proteicos, así como para cuantificar la colocación del presente en las células.
Esto puede ayudar a explicar la secuencia de eventos necesarios para la formación compleja y para la reparación del ADN. interacciones particulares con proteínaproteínas pueden implicarse de tales experimentos. Demostrando el procedimiento estará Barbara De La Pena, una foto Postdoc muy talentosa de mi laboratorio Begin por el cultivo de 40.000 células HeLa en cada bien sobre 12 pozos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 milímetros a 80% de confluencia.
Después de exponer las células a cuatro irradiaciones gamma grises, lávelas dos veces con un mililitro de PBS. A continuación, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de NDB a cada pozo. Incubar las células durante dos minutos a temperatura ambiente y luego retirar el NDB.
Tenga en cuenta que el tiempo de incubación puede variar dependiendo de la línea celular, pero generalmente no debe exceder los dos minutos. Lave las células con un mililitro de PBS. A continuación, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de 4%PFA a cada pozo para la fijación celular.
Incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, quite la PFA y agregue un mililitro de PBS a cada pozo. Retire el PBS por completo y luego agregue 200 microlitros de solución de bloqueo a cada pozo e incubar las células durante dos horas a temperatura ambiente o de 16 a 18 horas a cuatro grados centígrados.
diluir el anticuerpo primario y el tampón de dilución y el vórtice hasta que esté bien mezclado en una caja de humedad y aquí un trozo de parafilm y añadir 10 microlitros de anticuerpo primario en una sola gota. Alinee un borde del cubreobjetos del pozo con la gota y baje lentamente sobre la parafilma que esparce el líquido. incubar las cubiertas durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de la incubación, la cubierta se desliza tres veces en PBS durante un minuto por lavado. diluir el anticuerpo secundario y el tampón de dilución y el vórtice hasta que esté bien mezclado, aplicar 10 microlitros de anticuerpo secundario a cada cubrelip como se describió anteriormente e incubarlo durante dos horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave los resbalones de la cubierta tres veces con PBS y una vez con agua durante un minuto por lavado.
A continuación, montarlos en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol que contiene los sellos DAPI con esmalte de uñas transparente y dejar que se sequen durante 20 minutos. Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente objetivo de 60 x y utilice DAPI para localizar los núcleos a través del ocular para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y establezca el tipo de escáner como galvano el tipo de escáner como de ida y vuelta y 512 por 512 tamaño de imagen. En el panel PMT, establezca el modo en promedio VBM a fotograma y escaneo secuencial a línea.
A continuación, establezca el tinte y los detectores de calor para que el canal uno se active a DAPI y SD uno, el canal dos en alexafluor 488 y HSD tres, y el canal tres a alexafluor en 647 y HSD cuatro seleccione para Z.To ajustar la imagen en vivo, pulse el botón en vivo en la ventana en vivo y ajuste el enfoque. A continuación, utilice la ventana de herramientas PMT para establecer la sensibilidad de intensidad láser, ganancia y desplazamiento para pilas z, seleccione de principio a fin y 15 sectores. Seleccione la carpeta para guardar las imágenes y pulse el botón Inicio de LSM para empezar a adquirir.
Cuando haya terminado, pulse el botón de la serie para completar la adquisición de la imagen. Abra el software de análisis y, a continuación, pulse la ventana de herramientas por lotes y seleccione las imágenes que desea analizar. Vaya a la ventana de herramientas de análisis y seleccione la proyección, que mostrará la proyección de intensidad máxima de 15 sectores.
En la configuración de salida de entrada, seleccione el lote y la carpeta de salida creados. Proceso de prensa para que las imágenes se procesen y exporte las imágenes como archivos TIFF. Realizar la cuantificación nuclear con cellprofiler de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Las células no tratadas con la radiación presentan muy pocos signos de exposición gamma H2AX. En ausencia de proteínas esenciales de reparación del ADN, se puede observar la acumulación de gamma H2AX en las roturas del ADN. La acumulación de roturas no reparadas puede llevar a las células a volverse pre hipotónicas indicadas por núcleos gamma H2AX sólidos.
Después de la irradiación, los núcleos exhiben un gran número de roturas de doble hebra a las que la gamma H2AX se localiza extremadamente rápidamente. Mientras que pocos o ningún foco se observa en ausencia de una radiación, el número de focos se cuantificó en una dos cuatro y 16 horas después de una radiación y para el control de radiación noa. Dependiendo de la cuestión biológica planteada y del tipo de datos requeridos, se deben considerar las diferentes opciones de trazado Colocación mediante la multiplexación de anticuerpos primarios criados en diferentes especies animales y utilizando anticuerpos secundarios, se etiquetan con distintos fluoróforos.
Superposición de verde y rojo, da lugar a puntos de acceso amarillos, las dos proteínas de interés están presentes en los mismos píxeles. El análisis cuantitativo de la colocación se puede lograr mediante un enfoque basado en objetos o mediante un enfoque estadístico que realiza análisis basados en el coeficiente de correlación de intensidad. Una combinación de anticuerpos primarios criados en diferentes especies animales, se puede utilizar en este protocolo.
Asegúrese de que los anticuerpos son compatibles y no interfieran entre sí. Debe establecer adecuadamente el anticuerpo secundario que se utilizará contra cada uno de los anticuerpos primarios y considerar una superposición espectral particular al seleccionar la menor fuerza que se utilizará. La colocación o las proteínas indican posibles interacciones directas.
Esto puede ser verificado por precipitación granular en las células, o por la colocación directa usando proteínas purificadas in vitro.
