Generación de gotas y PCR digital de gotas para la cuantificación fiable de títulos del genoma viral de AAV en muestras de vectores

Para comenzar, prepare una muestra de AAV tratada de ADN y la mezcla maestra dd_PCR. Agregue 2,2 microlitros de la muestra diluida a 19,8 microlitros de dd_PCR mezcla maestra en cada tubo de la tira de ocho tubos de PCR y mezcle bien. Transfiera 20 microlitros de la mezcla a los pocillos contenidos en la fila de muestras del medio de un cartucho generador de gotas.

A continuación, transfiera 60 microlitros de aceite generador de gotas a los pozos contenidos en la fila inferior de aceite del cartucho generador de gotas. Coloque una junta de goma sobre el cartucho generador de gotas y, a continuación, colóquelo en el generador de gotas. Una vez generadas las gotas, utilice una pipeta de ocho canales para transferir lentamente 42,5 microlitros de solución desde el cartucho de generación de gotas a una placa de PCR de pocillos múltiples.

Selle la placa PCR con una cubierta de papel de aluminio utilizando una máquina de termosellado durante cinco segundos a 180 grados centígrados. Para la amplificación, coloque la placa en un termociclador con un módulo de reacción de pocillos de 96 pocillos de profundidad, ciérrelo de forma segura y ejecute el programa de PCR. Una vez hecho esto, cargue la placa en un lector de gotas, ingrese la información requerida en el software del sistema e inicie la lectura.

Se observó una clara separación entre gotas positivas y negativas en el gráfico de amplitud 1D, lo que sugiere una medición exitosa. El segundo gráfico de amplitud 1D mostró una lluvia de gotas con gotas dispersas entre las nubes positivas y negativas, lo que indica un problema potencial con la precisión de la medición. Los datos de salida de una ejecución de AAV mostraron resultados consistentes cuando una muestra se midió en duplicados en dos diluciones diferentes.