Para comenzar, recoja las plántulas de Columbia-0 Arabidopsis de cinco días congeladas, estresadas por calor y sin tratar, en el contenedor de nitrógeno líquido. Muele las plántulas con un homogeneizador hasta convertirlas en polvo durante un minuto. A continuación, añada 500 microlitros de tampón de extracción de polisomas al tubo.
Invierta y haga vórtice el tubo para mezclar la muestra. Centrifugar la solución de extracción a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, filtre el sobrenadante a través de un filtro de celdas de 100 micrómetros para obtener una solución de extracción clara y sin partículas.
Cargue el sobrenadante filtrado en el gradiente de sacarosa preparado previamente y espere hasta que alcance el equilibrio. A continuación, ultracentrífuga el gradiente utilizando un rotor de cangilón oscilante a 210.000 G durante 3,5 horas a cuatro grados centígrados con tasas máximas de aceleración y desaceleración. El ARN polisomal y no polisomal se separan en función de su densidad en la solución de gradiente de sacarosa correspondiente.
Prepare la solución de persecución para la bomba de jeringa de microvolumen que consta de 70 % de sacarosa, 10 % de glicerol y 0,02 % de azul de bromofenol. Mezcle bien la solución durante 30 a 40 minutos. Después de inyectar la solución de persecución en el gradiente, usando el software, controle el fraccionador de gradiente de densidad.
A continuación, calibrar la máquina con agua desionizada. Después de la ultracentrifugación, coloque el tubo en el fraccionador de gradiente de densidad. Usando el sistema de perforación de tubos, conecte el tubo a la bomba de jeringa y al detector de rayos ultravioleta.
Cambie el fraccionador de gradiente de densidad al modo de control remoto por software. Ajuste el caudal de inyección de la bomba de jeringa de microvolumen a tres mililitros por minuto. Inicie el proceso para obtener el gráfico de perfil de polisomas midiendo la densidad óptica a 254 nanómetros utilizando el fraccionador.
Sobre la base de las mediciones del perfil de polisomas, recoja las fracciones de ARN polisomal y no polisomal por separado. Mezcle bien las fracciones de ARN recolectadas con una solución prefría con dos veces alto en sal. A continuación, añada ocho microlitros de un caldo diluido de control de ARN poli-A eucariota del kit.
Centrifugar la solución de ARN mezclado con alto contenido de sal con un rotor de cangilón oscilante a 450.000 G durante cinco horas a cuatro grados centígrados. Vierta con cuidado el sobrenadante y lave el pellet de ARN tres veces con 500 microlitros de agua prefría tratada con DEPC. Después del último lavado, agregue 500 microlitros de reactivo de extracción de ARN a la muestra de ARN.
Mezclar e incubar durante 10 minutos. Agregue 100 microlitros de cloroformo y mezcle bien. Incubar durante 10 minutos para permitir la separación de fases.
Centrifugar la mezcla a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la capa acuosa transparente superior que contiene ARN a un nuevo tubo y mézclelo suavemente con un volumen igual de isopropanol. Incubar la mezcla a menos 20 grados centígrados durante dos horas para precipitar el ARN.
Después de la precipitación, centrifugar nuevamente y desechar el sobrenadante, dejando la bolita de ARN en el fondo. Lave el pellet de ARN con un mililitro de etanol prefrío al 75%. Centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y secar al aire la pastilla de ARN.
Tras el secado, vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de agua tratada con DEPC. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de espectro completo de 220 a 750 nanómetros, centrándose en la densidad óptica de 260. El perfil de polisomas mostró una clara separación entre las fracciones polisomales y no polisomales en condiciones normales.
El estrés térmico a 40 grados centígrados redujo significativamente la intensidad de la señal de la fracción polisomal, y este efecto se revirtió después de una recuperación de dos horas a 22 grados centígrados, devolviendo la señal a los niveles de control. Los resultados de la extracción de ARN indicaron que el estrés térmico redujo el porcentaje de ARN en la fracción polisomal, que se restauró después de la recuperación a 22 grados centígrados.
