Este protocolo describe cómo generar un perfil polisomático que revela detalles moleculares sobre la actividad de los ribosomas dentro de la célula. Esta técnica permite a los usuarios obtener la valiosa información proporcionada por un perfil polisómico, que no tiene acceso a sistemas automatizados de fraccionamiento de gradiente. Tómese su tiempo mientras prepara los gradientes y guárdelos en un lugar donde no se vean interrumpidos por un compresor u otras operaciones mecánicas a medida que se asientan en un gradiente lineal.
Para comenzar, prepare soluciones madre de sacarosa al 7 y 47% en tampón de gradiente de sacarosa. Filtro esterilizar las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 micras. Prepare 14 mililitros de soluciones de sacarosa al 17, 27 y 37% dispensando y mezclando las soluciones de 7 y 47% de existencias.
Coloque seis tubos centrífugos de polipropileno en un bastidor de tubos de ensayo de vista completa. Asegúrese de que haya suficiente espacio entre los tubos para que las acciones con un tubo no perturben a los demás. Conecte una aguja de nueve pulgadas y calibre 22 con una punta roma a una jeringa de tres mililitros, y realice un llenado y dispensación de prueba para asegurarse de que la jeringa pueda contener la solución de sacarosa sin gotear antes de configurar los gradientes.
Agregue dos mililitros de sacarosa al 7% al fondo de cada tubo de centrífuga. Luego, agregue dos mililitros de sacarosa al 17% debajo de la solución al 7%, colocando la punta de la aguja dentro de las inmediaciones del fondo del tubo. Dispense la solución con cuidado y lentamente.
Repita el procedimiento con dos mililitros cada uno de la solución de sacarosa al 27, 37 y 47%, asegurándose de que cada capa se distinga de la otra por una línea que marque la separación de densidades. Almacene los gradientes a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que se asienten en un porcentaje continuo y creciente de sacarosa. Después del crecimiento y la cosecha de levadura, las células de Saccharomyces cerevisiae, resuspenden las células en 700 microlitros refrigerados de tampón de extracción de polisomas.
Añadir 100 unidades de inhibidor de la ARNsa. Luego, agregue 400 microlitros de perlas de vidrio preenfriadas con un tamaño aproximado de 425 a 600 micras. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con las perlas de vidrio e interrumpa las células de levadura mediante una agitación vigorosa en un batidor de cuentas durante cinco minutos.
Después de interrumpir las células, aclarar el lisado por centrifugación. Determine la concentración del ARN en el lisado clarificado midiendo la absorbancia a 260 nanómetros, utilizando un sistema de detección de ARN basado en fluorescencia. Asegúrese de que la concentración de ARN sea de 0,5 a un microgramo por microlitro.
Si la concentración de ARN es demasiado baja, reduzca el volumen de tampón de extracción utilizado para resuspender las células. Cargue cuidadosamente el lisado en la parte superior de los degradados. Coloque la punta de la pipeta contra la pared interior en la parte superior del tubo de polipropileno.
Incline el tubo y dispense lentamente el lisado en la parte superior del degradado, goteando contra la pared. Coloque suavemente los tubos en los cubos preenfriados de un rotor de cangilón oscilante y centrifugar los gradientes. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos de centrífuga del rotor del cucharón oscilante y colóquelos en un soporte de tubos.
Etiquete las placas de 96 pocillos para almacenar las fracciones y preenfriarlas en hielo. Recoja fracciones de 100 o 200 microlitros a partir de la parte superior del degradado, insertando cuidadosamente una punta de pipeta en la parte superior del degradado y recogiendo las fracciones hasta que todo el gradiente sea alícuoto. Mida la absorbancia de cada fracción a 254 nanómetros con un espectrofotómetro contra las soluciones de sacarosa al 7 y 47% como espacios en blanco.
Cree el perfil del polisoma trazando el número de fracción frente a la absorbancia. Se muestran tres perfiles de polisomas representativos de la levadura S.Cerevisiae. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma es evidente en cada perfil.
Aquí se muestra un perfil representativo de un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad. Este perfil se produjo a partir de un perfil de absorbancia continua ya que el gradiente de sacarosa fue desplazado de abajo hacia arriba por una solución de persecución, a través de una celda de flujo detector y recogido en fracciones. Aquí se muestra el perfil polisomal generado por fraccionamiento manual de muestras de 200 y 100 microlitros.
Lo más importante que debe recordar con este procedimiento es no interrumpir los gradientes. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire o interrumpir el gradiente al dispensar la solución demasiado rápido. Después de este procedimiento, se puede extraer ARN de los gradientes para su posterior análisis para determinar los ARNm que se asocian con ribosomas activos.
