El flujo de trabajo consiste en cultivar células en condiciones ambientales estrictamente controladas, enfriarlas rápidamente utilizando agua de fusión / hielo y fijarlas con una concentración preoptimizada de formaldehído y tiempo de incubación. La reacción de fijación se apaga utilizando el exceso de compuestos que contienen grupos amino primarios, como la glicina o los tryps. Las células se recogen, se lavan y se pueden almacenar congeladas.
Las células fijas se pueden lisar mecánica o químicamente, y el lisado se utiliza para la separación de las fracciones ribosómicas en función de su tamaño molecular, propiedades de sedimentación o marcadores de afinidad. El enfoque da como resultado un material versátil utilizable para la purificación y detección inmunoasistida, el enriquecimiento de complejos que contienen factores específicos en microscopía electrónica. Tras el bloqueo profundo reticulado, la amplificación de ARN o los análisis basados en hibridación, la secuenciación de ARN y la espectrometría de masas se vuelven posibles.
Configure un cultivo de levadura de un litro en un agitador orbital con una densidad óptica inicial de no más de 0,05 unidades de absorbancia a 600 nanómetros y use medios de peptona y dextrosa a 30 grados centígrados. Instale una centrífuga preparativa con botellas de rotor y centrífuga compatibles para peletizar la suspensión líquida de las células de levadura a 5000 G a cuatro grados centígrados. Mantenga un registro de la densidad óptica de las células en crecimiento.
Debe estar entre 0,6 a 0,8 unidades de absorbancia y 600 nanómetros en el momento de la recolección si la fase de crecimiento exponencial es de interés. Una vez que las células estén listas, coloque una caja de hielo dentro de la campana de humos químicos con un panadero que contenga 250 gramos de hielo de agua triturada limpia y muéstrele también 25 mililitros de tripsina y solución de metanol estabilizado al 37% formaldehído recién comprado dentro de la campana. Vierta el último cultivo celular en el panadero que contiene el hielo.
Luego agregue 75 mililitros de formaldehído al 37% a una concentración final de 2.2% de peso sobre el volumen, revuelva intensamente la mezcla hasta que el hielo se derrita. Una vez que el hielo se derrita, configure un temporizador durante 10 minutos Después de incubar durante 10 minutos, transfiera el cultivo a las botellas de centrífuga preenfriadas y gine las células por centrifugación a cuatro grados centígrados, 5000 G durante cinco minutos. Mientras está el centrifugado, enfríe previamente un tubo de 50 mililitros y mantenga el tampón A recién preparado que contiene glicina para neutralizar cualquier formaldehído restante en el hielo.
Después de centrifugar, coloque los tubos de la centrífuga sobre hielo con el lado del pellet en contacto con el hielo. Lleve los tubos a la campana extractora de humos y deseche el sobrenadante en un contenedor de residuos de formaldehído. Vuelva a suspender el pellet celular de tubos viejos en 20 mililitros de tampón A usando una stripette de 25 mililitros y transfiriéndolo a un tubo de 50 mililitros.
Suba el volumen a 40 mililitros con tampón A y recoja las celdas de lavado por centrifugación de cuatro grados centígrados, 5000 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en un tampón A de 40 mililitros, que es el tampón A que no contiene glicina para eliminar la contaminación por glicina. Pellet las células de nuevo por centrifugación a cuatro grados centígrados, 5000 G cinco minutos.
Repetir los lavados con tampón A uno, una vez más. Deseche el sobrenadante y coloque el gránulo celular sobre hielo. Pesar el tubo con el pellet, la masa celular húmeda debe ser de aproximadamente un gramo por un litro del cultivo celular.
Llene el poliestireno de la caja forrada con papel de aluminio con nitrógeno líquido a una profundidad de aproximadamente tres centímetros. Coloque en el tubo de 50 mililitros en posición vertical en la caja. Vuelva a suspender el pellet en 550 microlitros de tampón A dos mediante pipeteo y vórtice durante 10 segundos.
Agregue 10 microlitros de 40 unidades por inhibidor de la RNasa de microlitro y vórtice nuevamente durante 10 segundos. Usando una pipeta de un mililitro, gotee la suspensión celular en el dos de 50 mililitros que contiene el nitrógeno líquido. Para prepararse para el siguiente paso, preenfríe tubos libres de núcleo de 1,5 mililitros en hielo seco y frascos de molienda de acero inoxidable de 10 mililitros.
Transfiera las gotas de suspensión de células congeladas a los frascos usando una espátula estéril limpia. Sumerja los frascos de molienda en nitrógeno líquido durante un minuto, asegurando que la fase líquida permanezca por encima de la unión. Instale un molino mezclador Cryo a 27 Hertz para agitar durante un minuto.
Agite los frascos de molienda sellados a 27 Hertz durante un minuto en el molino mezclador. Vuelva a enfriar los frascos en nitrógeno líquido como antes y agite durante un minuto más. Transfiera los frascos a la caja de hielo que contiene hielo seco junto con los tubos libres de núcleo de 1,5 mililitros.
Usando una pequeña espátula de acero, transfiera los resultados en la fecha de molienda acolchada en los tubos. Luego guarde los tubos a menos 80 grados centígrados. En dos matraces T175 crecen células HEK 293 a 60 a 70% de confluencia y el medio Eagle modificado de Dalbeko y el suero bovino fetal de 10% a 37 grados y 5% de dióxido de carbono.
Al menos tres horas antes del tiempo de fijación deseado, reemplace el soporte del matraz T175 con exactamente 30 mililitros de medios completos precalentados. Prepare una caja de hielo hasta el borde con hielo de agua triturada y manténgala en la campana de humos junto con los amortiguadores requeridos, también un hielo. Para enfriar las células, retire el matraz T175 de la incubadora y presiónelo formalmente contra el hielo asegurando el máximo contacto con la superficie.
Dentro de una campana de humos químicos, incline el matraz hacia un lado para que el medio se acumule en el lado opuesto a las células. Pipete 168 microlitros de 37% pesados por volumen formaldehído directamente en el medio agrupado. Dando una concentración final de 0,2% de formaldehído.
Mezclar inmediatamente. Incubar los matraces en hielo durante 10 minutos más. Vierta el medio en un recipiente de desechos apropiado a través del lado del matraz opuesto a las celdas.
Usando un strippete, pipete en 30 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko sin iones de calcio y magnesio y que además contiene 50 milimolares de glicina suavemente en el lado opuesto a las células. Mezclar meciendo el matraz, devolver el destello a posición horizontal e incubar durante 10 minutos más sobre hielo. Vierta la solución a través del lado del matraz opuesto a la celda y agregue suavemente siete mililitros de solución estándar de EDTA de tripsina al 0,25% para separar y volver a suspender las células.
Incubar el matraz a temperatura ambiente durante cinco, máximo 10 minutos. Ubique el matraz verticalmente y con un strippete, recoja las celdas desprendidas lavando suavemente los restos de las paredes del matraz y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros sobre hielo. Complemente inmediatamente la solución de suspensión recolectada con 20 mililitros de medios completos y mezcle volteando suavemente el tubo.
Granular las células centrifugando el tubo a 100 G durante cinco minutos y cuatro grados centígrados. El pellet celular debe ser claramente visible. Vierta el medio y vuelva a suspender suavemente el pellet en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko sin glicina.
Centrifugar el tubo de nuevo a 100 G durante cinco minutos y a cuatro grados centígrados Verter el tampón de lavado y volver a suspender el pellet en 800 microlitros de solución salina tamponada con fosfato de Dalbeko helada sin glicina, pero que contiene iones de magnesio y calcio. Transfiera las células resuspendidas a un nuevo tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas. Centrifugar el tubo a 100 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de mililitros. En esta etapa, el pellet celular se puede congelar a menos 80 grados centígrados o proceder a la etapa de lisis celular. En un gabinete de bioseguridad agregue 300 microlitros de tampón de lisis a base de detergente no iónico, no desnaturalizante y siete microlitros de inhibidor de arginasa y mezcle bien mediante pipeteo con una punta de mililitro.
Conecte cuidadosamente una aguja de calibre 25 a una jeringa de uno a tres mililitros y pipetee vigorosamente la mezcla utilizando al menos siete golpes de admisión lenta hacia arriba y rápido hacia abajo. Deseche la jeringa y la aguja en el contenedor del afilador y repita el procedimiento con una aguja de calibre 31 y una jeringa de 0,3 mililitros. Deseche la jeringa y la aguja en el contenedor del afilado.
Centrifugar el tubo a 12. 000 G durante cinco minutos a cuatro grados para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 mililitros. Almacene tanto los restos celulares como el lisado a menos 80 grados centígrados.
Los complejos traslacionales son sensibles a la composición iónica de los tampones. La omisión de cloruro de magnesio y la adición de EDTA abrogaron altas propiedades de sedimentación, y aunque el cloruro de calcio dio lugar a mejores picos de resultados, la mejora fue marginal. Por lo tanto, seleccionamos el búfer uno.
El 2,2% en peso por volumen formaldehído preservó excelentemente los polisomas y no disminuyó el rendimiento general en comparación con el 4% en peso por volumen formaldehído. En las células de mamíferos, se utilizó una concentración mucho menor de formaldehído de 0,2% en peso por volumen. A medida que las concentraciones más altas resultaron en una pérdida sustancial de material poliribosomal.
15 milimolares EDTA añadidos al lisado y todos los tampones posteriores exhibieron un efecto de desestabilización distintivamente menor en las fracciones polisomales, derivadas de las células fijas. Y este efecto se replicó parcialmente con EDTA 50 milimolares con material de células fijas al 4%, resistiendo, desplegándose mejor. El agotamiento de la glucosa provoca uno de los efectos inhibitorios de traducción más dramáticos y rápidos sobre la levadura.
Tanto el nervio añadido como las condiciones de causa local inducidas por el desmontaje de polisomas fue leve, pero evidentemente más polisomas retenidos en la glucosa agregada baja. Es importante destacar que el material polisomal de las células fijas demuestra una alta distinción entre las células hambrientas y las no hambrientas, lo que indica la idoneidad de la fijación de formaldehído para preservar las diferencias en los procesos de traslación dinámicos. En enfoques como el paysake tacy, también puede ser perspicaz eliminar pequeñas subunidades ribosómicas que no se asientan bien con los rizomas completos para los que empleamos una ultracentrifugación de dos etapas, lo que permite el aislamiento de SSU, LSU, RS, diazomas resistentes a la RNasa, DS y polisomas de alto orden confirmados por microscopía electrónica de las fracciones fijas.
En comparación con las células no fijas, el material de las células fijas demostró una presencia elevada de eIF4A lábil en las fracciones ribosómicas de sedimentación más rápidas. Utilizando material fijo de la cepa eIF4A tapi para capturar y enriquecer eIF4A que contiene complejos con perlas magnéticas IDG, pudimos observar un enriquecimiento selectivo de la eIF4A en comparación con la beta-actina en SSU y RS, pero no fracciones LSU del segundo gradiente en el desmontaje de RNase one. En comparación con otros métodos de reposo traslacional, la rapidez de la acción del formaldehído a través de las membranas celulares y la naturaleza indiscriminada de los enlaces cruzados prometen la preservación de la máxima diversidad de los intermedios complejos de traducción.
Nuestros hallazgos conforman la usabilidad de la fijación rápida de formaldehído para estabilizar complejos altamente transitorios y evidencian la utilidad en los escenarios de respuestas celulares rápidas a cambios ambientales o condiciones de estrés.
