La huella dactilar de ADN es una herramienta común en las ciencias biológicas y aplicada en las pruebas de paternidad, así como en los estudios forenses o filogenéticos. Este protocolo está diseñado para proporcionar a los estudiantes de pregrado los principios básicos de la huella digital de ADN en las clases de laboratorio. Se basa en el locus humano D1S80, un número variable de repeticiones en tándem de la región, que los alelos pueden diferir en longitud entre los individuos.
La extracción de ADN, pcr, electroforesis en gel y análisis posteriores pueden ser difíciles de realizar, especialmente si se realiza por primera vez. La demostración visual de todos los pasos permite a los espectadores observar la práctica general, los detalles y las precauciones que se deben tomar al llevar a cabo este protocolo tan robusto. Para extraer ADN de las células epiteliales de la mucosa bucal, comience por cosechar las células usando un hisopo oral estéril.
Use un hisopo para frotar vigorosamente en el interior de la mejilla durante 30 a 40 segundos. Coloque la punta del hisopo de recolección en el tubo de microcentrifugación estéril etiquetado y rompa la longitud del plástico que se extiende más allá del borde, y cierre el tubo. Precaliente un bloque de calefacción a 65 grados Centígrados y prepare todos los amortiguadores y soluciones necesarios.
Agregue 500 microlitros de solución de lisa al hisopo, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida en la solución de lisa y abilicen la muestra durante al menos cinco segundos. Incubar la muestra durante 10 minutos a 65 grados centígrados y vórtice de vez en cuando. Después de la incubación, retire el hisopo presionándolo contra la pared del tubo para obtener un volumen de muestra máximo.
Agregue 100 tampón de desnaturalización de microlitro para lisear las células y mezcle a fondo invirtiendo el tubo hasta que un precipitado blanco se haga visible. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego centrifugar la muestra durante cinco minutos a 17, 950 G.Transferir 450 microlitros del sobrenadante en un tubo de microcentrifugación limpio de 1,5 mililitros. A continuación, añadir 450 microlitro de iso 2-propanol y mezclar bien invirtiendo el tubo para precipitar el ADN.
Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente y centrífuga durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante e invierta el tubo en una toalla de papel limpia y seque el pellet. Lave el ADN con 500 microlitros de etanol al 70%, centrífuga en breve durante un minuto y deseche el sobrenadante.
Para secar el pellet por completo, incube la muestra durante cinco minutos a 65 grados centígrados en un bloque de calefacción. Finalmente, agregue 30 microlitros de tampón de elución e incube durante 10 minutos a 65 grados Celsius para inactivar el sistema de ADN. Prepare la mezcla maestra agregando el tampón de PCR verde, DNTPs, cebadores, agua y polimerasa al tubo de microcentrifugación.
Etiquete los tubos de PCR con números de muestra y alícuota de 45 microlitros de la mezcla maestra de PCR a cada tubo de PCR. A continuación, agregue cinco microlitros de ADN o, para el control sin plantilla, agregue agua. Cierre los tubos de PCR y centrífugalos brevemente.
Coloque los tubos en el ciclador térmico e inicie el programa de PCR. Cuando se complete el programa, almacene las muestras a cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Prepare un gel de agarosa al 1,5% pesando 1 1/2 gramos de polvo de agarosa y mezclándolo con 100 mililitros de solución tampón tae en una botella.
Calentar la mezcla de agarosa cuidadosamente en un microondas y remolino la mezcla en el medio hasta que la agarosa se haya disuelto por completo. Tenga en cuenta que pueden producirse retrasos en la ebullición. Después de un breve enfriamiento de la mezcla de agarosa, agregue dos microlitros de Pec verde.
Vierta el gel y use un peine con suficientes pozos para las muestras. Después de la polimerización completa del gel de agarosa, cargue los pozos con 10 microlitro de cada una de las muestras de PCR y agregue un estándar de peso molecular a los pozos de flanqueo. Ejecute el gel a 150 voltios durante aproximadamente 40 minutos.
Para visualizar los productos de PCR, imagen del gel usando luz ultravioleta. Para el análisis de los alelos amplificados D1S80, coloque una regla junto al estándar de peso molecular a partir de los pozos en la imagen del gel fotográfico. Mida la distancia para cada banda del estándar de peso y registre las longitudes en un programa de cálculo de tabla.
A continuación, determine el logaritmo de cada tamaño de fragmento del estándar de peso. Inserte una gráfica de dispersión utilizando tamaños de fragmentos estándar de peso transformados en logaritmo y las distancias medidas desde su gel. Ajuste una línea de tendencia y muestre la ecuación de regresión y el valor de R cuadrado.
En una nueva tabla, inserte las distancias de las medidas desde los amplicones de PCR hasta los pozos. Para determinar el tamaño de estos amplicones, utilice la ecuación de regresión de la regresión lineal y calcule el antilog para obtener los tamaños de fragmento en pares de bases a partir de los amplicones. Finalmente asigne las unidades de repetición de 16 pares de bases a cada amplicon medido.
La extracción de ADN y la amplificación del locus D1S80 fue exitosa para todos los individuos estudiados, y el control sin plantilla en el carril 10 no mostró ningún amplicons. A partir del análisis de la longitud del fragmento, los individuos fueron clasificados en ser homocigóticos o heterocigotos con dos alelos. El número de unidades de repetición de las repeticiones en tándem era claramente relatable, y ahora puede servir para un análisis más detallado.
Aquí describimos un método simple y rentable para implementar la huella molecular en las clases prácticas de pregrado. Todo el procedimiento se puede completar dentro de un solo día de trabajo, y consta de cuatro pasos diferentes. En el primer paso, se prepara la plantilla de ADN.
Las células epiteliales bucales se cosechan por muestreo de hisopos. Los hisopos orales son una herramienta confiable para proporcionar suficiente cantidad y calidad de células para la extracción de ADN. Además, el protocolo de extracción de ADN no utiliza disolventes orgánicos, lo que es ventajoso en las clases de laboratorio de pregrado.
El primer paso se puede completar en 90 minutos o menos. En el segundo paso, el lugar geométrico D1S80 es amplificado por la polimerización en cadena. Las condiciones de PCR presentadas aquí son robustas incluso en caso de mala calidad de la plantilla de ADN.
Este paso se puede completar en 2 1/2 horas. Los productos de PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa tiene muchas ventajas en comparación con otras técnicas, como la evitación de componentes peligrosos y una técnica de preparación simple.
Este análisis se puede completar en 90 minutos. Después de la electroforesis, los resultados de la longitud del fragmento se pueden analizar en 90 minutos mediante un análisis de regresión lineal, ya sea mediante un programa de cálculo de tablas o mediante una calculadora simple. En resumen, el método de huellas dactilares presentado se puede utilizar en prácticas prácticas para enseñar el uso de marcadores moleculares y su aplicación en la ciencia biológica.
