Estos estudios fueron financiados por el Wellcome Trust del Reino Unido y la meningitis. HBMEC línea celular fue proporcionada por el Dr. KS Kim. Microscopía confocal y microscopía electrónica se realizaron en el Fondo para el Bioimagen Wolfson, de la Universidad de Bristol. También nos gustaría agradecer al Sr. Alan Leard, el Dr. Mark Jepson (Universidad de Bristol), y el Sr. Alan Tilley (PerkinElmer) por su ayuda y consejo.

1. Inmunofluorescencia Protocolo La siembra, la infección y inmuno-tinción Los procedimientos siguientes requieren un nivel adecuado de seguridad y las instalaciones de cultivo de tejidos microbiológicos de laboratorio. DIA 1 A. Preparación de las células diana para la infección <ol><li> HBMECs de semillas a 50% de confluencia (~ 1.5x10 4 células / cm 2) en cubreobjetos de vidrio (16 mm de diámetro) se coloca en una placa de 12 pocillos (3,8 cm 2 área de crecimiento / y). Medio de cultivo: RPMI 1640 suplementado con 15% inactivado por calor (56 ° C, 30min) de SFB, 2 mM de glutamina, 1 mM piruvato sódico, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina al 1% (v / v) MEM no aminoácidos esenciales ácidos solución y solución al 1% MEM vitaminas. </li><li> Cultura durante la noche (O / N) a 37 ° C, en un 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> B. cultivo bacteriano <ol><li> Crecimiento de la cepa de interés O / N (16-18 h) en el medio de la infusión por ejemplo, requiere de cerebro y corazón (BHI) placas de agar suplementado con sangre de caballo al 10% se calienta a 37 ° C en 5% de atmósfera de CO 2 4. </li></ol> DIA 2 A. Preparación de bacterias (N. meningitidis) Suspensión <ol><li> El uso de un bucle de la cultura l 10, hacer una suspensión del cultivo bacteriano durante la noche en 2 ml PBSB (PBS con calcio y magnesio). </li><li> Permiten a las grandes agregados bacterianos a resolver, de salir de la suspensión durante 5 min a temperatura ambiente (TA). </li><li> Sin perturbar el sedimento, la transferencia de la parte superior de 1 ml de la suspensión (stock de inóculo) en un tubo estéril. </li><li> Para estimar el número de bacterias en el inóculo de valores, añadir alícuotas (20-50 l) de los tubos que contienen los volúmenes de 1 ml de SDS al 1% en 0,1 M de NaOH y mezclar suavemente hasta disolver. </li><li> Medir el contenido de ácido nucleico de la solución mediante la determinación de la absorbancia a 260 nm (A260). En nuestras manos, A260 de 1 corresponde a 5x10 8 unidades formadoras de colonias / ml (ufc / ml). Esto se puede verificar mediante la preparación de una serie de diluciones del inóculo de valores en PBSB, enchapado en placas de agar y el recuento de colonias después de O / N de incubación. </li><li> Diluir una alícuota del inóculo de valores en el medio de infección [(M199 suplementado con 2% decomplemented (56 ° C, 30min) de suero humano normal (NHS)] para obtener la densidad requerida de bacterias en la infección de las células diana. <ol><li> En nuestro laboratorio, una relación de la infección de 200 a 300 bacterias por célula diana se utiliza habitualmente. </li></ol></li></ol> Celular B. Cultura infección <ol><li> Lave el cubreobjetos con las células diana cultivadas 3 veces con medio de Hank para eliminar cualquier rastro de los antibióticos. </li><li> Infectar a las células recién preparada con suspensiones bacterianas (descrito anteriormente) durante 3 horas a 8 horas a 37 ° C, en el 5% de CO 2. </li><li> Al final del periodo de infección, lávese las células tres veces con PBS y fijar en 500 l de 2% de paraformaldehído (PFA) durante 30-45 minutos a temperatura ambiente o S / N a 4 ° C. <ol><li> La fijación de paraformaldehído en la concentración y el tiempo se muestra más arriba se encontró que era adecuada para la preservación de la morfología bacteriana y celular. </li></ol></li><li> Después de lavar paraformaldehído, permeabilizar las células paraformaldehído-fijo mediante la incubación en el 0,1% Triton X-100 diluido en PBS durante 10 minutos. </li><li> Lavar las muestras 3 veces con PBS. </li><li> Proceder a la inmuno-tinción, o bien, dejar muestras de 500 l de BSA al 1% / PBST O / N a 4 ° C. </li></ol> DÍA 3 Inmunotinción Tinción de bacterias intracelulares y α-actinina se puede realizar de forma secuencial o simultánea con el uso apropiado de anticuerpos primarios y secundarios de la siguiente manera, todos los procedimientos pueden ser realizados en placas de 12 pocillos. <ol><li> Bloquear los cubreobjetos que contienen las células permeabilizadas con 500 l de 3% de BSA / PBST (PBS con 0,05% Triton X-100) durante 30-60 minutos a temperatura ambiente </li><li> Después de lavar con PBS, la transferencia de cada cubreobjetos con un pozo seco en la nueva placa de 12 pocillos. </li><li> Añadir los anticuerpos primarios contra las bacterias y α-actinina, de ochenta a 100 L de anticuerpo por cubreobjetos es suficiente si se añade con cuidado para cubrir la superficie del cubreobjetos. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. <ol><li> Se utilizó un antisuero policlonal de conejo contra la Neisseria meningitidis (de laboratorio criados) y el anticuerpo monoclonal de ratón (MAB) en contra de α-actinina (Abcam) al mismo tiempo. En algunos experimentos, en lugar de anti α-actinina, mAbs contra la actina y vimentina fueron utilizados (Sigma). </li></ol></li><li> Al final de la incubación, añadir 200 l de PBS para el bien, levantar el cubreobjetos y colocarlo en un nuevo pozo que contiene 500 l de PBS. </li><li> Después de 5 minutos, retire PBS con la pipeta y luego añadir PBS. Repita dos veces. Transferencia a un cubreobjetospozo seco nuevo. </li><li> Añadir los anticuerpos adecuados secundario conjugado con fluorocromos diferentes diluido en BSA al 1% / PBST, se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. <ol><li> Para la detección de bacterias, se utilizó anti-conejo conjugado con TRITC Ig y para la detección de la proteína α-actinina y otros citoesqueleto, se utilizó Ig anti-ratón conjugado con FITC o-(Sigma) o Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Al final de la incubación, lavar como en los pasos 4 y 5. </li><li> Contador mancha con 0,6 mg / ml en PBS DAPI (mancha de ADN) por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Enjuagar con PBS. </li><li> Monte cubreobjetos (células boca abajo) sobre portaobjetos con una gota de medio de montaje (e, g. Mowiol o Vectashield) </li><li> Almacenar en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Muestras están listas para la observación bajo el microscopio. </li></ol> 2. Láser confocal de microscopía de barrido (CLSM) Para observar y capturar imágenes de bacterias intracelulares y elementos del citoesqueleto, se utilizaron muestras de immunolabelled y las imágenes capturadas con una cámara Leica SP5-AOBS microscopio láser confocal de barrido unido a una Leica DM i6000 microscopio de epifluorescencia invertida. Todas las imágenes se recopilaron mediante un 63x 1,4 NA objetivo de inmersión en el aceite y el proceso con el software de Leica. CLSM procedimiento: <ol><li> Para comenzar el procedimiento CLSM, añadir una gota de aceite de inmersión con el objetivo y el lugar de la diapositiva muestra, cubreobjetos hacia abajo, en la platina del microscopio. </li><li> Ajuste el microscopio para determinar un modo visual y encuentre el área de interés usando las piezas del ojo del microscopio. </li><li> Uso del software de Leica, seleccione el modo de adquisición xyz. </li><li> Seleccionar el formato de 512 x 512 (tamaño del fotograma). Para los estudios de colocalización, la resolución más alta, más precisa será la imagen, teniendo en cuenta el límite de resolución del microscopio. A continuación, seleccione el modo bidireccional X, lo que aumentará la velocidad de exploración y ayudar a reducir el foto-blanqueo. </li><li> Configurar ajustes de escaneo secuencial. Haga clic en la &quot;ss&quot; función y elegir uno de los modos de escaneo. Usamos &quot;entre líneas&quot; de modo. </li><li> Seleccione rayos láser de acuerdo con los fluorocromos conjugado con los anticuerpos secundarios: 405 nm para DAPI (azul), 488 nm para Alexa Fluor 488 (verde) y 561 nm para TRITC (rojo). Activar el tubo fotomultiplicador (PMT) 1, 2 y 3, respectivamente. Ajustar la configuración de la PMT para detectar la longitud de onda correcta emisión. </li><li> Establecer la parte superior (&quot;begin&quot;) e inferior (&quot;end&quot;) de z-pilas o series. A continuación, establezca la necesaria &quot;z-el tamaño de paso&quot;. <ol><li> Neisseria meningitidis es un diplococo (Figura 1G) y dado que cada coco tiene un diámetro aproximado de 0,5 micras, el tamaño z paso de 0,20 micras fue elegido para mejorar la probabilidad de modo que cada coco por lo menos dos veces. Es también en el tamaño de paso para una resolución óptima de 0,1 a 0,2 micras. </li></ol></li><li> Establecer los parámetros de análisis final, seleccionando un promedio de línea de 3 para mejorar la relación señal-ruido. </li><li> Al hacer clic en &quot;Inicio&quot; imágenes de doble o triple del manchar-se obtienen mediante el análisis secuencial de diferentes longitudes de onda para eliminar la diafonía entre los cromóforos diferentes. </li><li> Para tener una idea de la colocalización de dos fluorocromos, seleccione la opción &quot;overlay&quot; la función para fusionar los canales seleccionados en una sola imagen, por ejemplo, cuando ambos Alexa 488 (verde) y TRITC fluorocromos (rojo) colocalise, color amarillo aparece en la imagen superpuesta . </li><li> Compilar z-pilas o series con la &quot;máxima proyección&quot; la función para la construcción de una imagen 2D necesarios para la visualización de colocalización posible. Un análisis más detallado de la colocalización puede obtener mediante el análisis de cada sección óptica. </li><li> Después de adquirir el z-pilas o series, proceso de datos para obtener una imagen ortogonal para la visualización de la localización intracelular de diversos elementos (Figura 1). </li></ol> 3. Cuantificación de la colocalización Los análisis estadísticos de las imágenes del microscopio confocal de barrido se llevan a cabo con el software Volocity (Improvisación, PerkinElmer). Este software proporciona una herramienta diseñada específicamente para el análisis de colocalización según lo descrito por Manders et al. (1993) 5. Colocalización en el contexto de la imagen digital de fluorescencia se puede describir como la detección de una señal en el mismo voxel (volumen píxeles) la ubicación de cada canal. Los dos canales se componen de imágenes de dos fluorocromos diferentes desde la zona de la misma muestra (guía Volocity usuario). Los análisis estadísticos se realizaron con el software Volocity (Improvisación, PerkinElmer) mediante análisis de colocalización cuantitativos se describen a continuación. Análisis cuantitativo de colocalización <ol><li> Crear una biblioteca de imágenes CLSM el uso de software Volocity. </li><li> Seleccione &quot;enfoque ampliado&quot; de la imagen en la barra superior. Esta herramienta de compilación z-pilas en una imagen 2D a analizar. </li><li> Seleccione &quot;colocalización&quot; de la herramienta. Los dos canales a analizar debe tener la misma profundidad de color. </li><li> Seleccionar el área que va a ser cuantificados. Establecer el umbral para eliminar cualquier fondo. </li><li> Crear la salida de la colocalización seleccionando la opción &quot;generar colocalización&quot;. Estadísticas de colocalización se generan para las regiones de interés previamente seleccionados. </li><li> Seleccione Manders coeficientes de R (coeficiente de coincidencia) y Mi (coeficiente de colocalización). <ol><li> Coeficientes Manders no son sensibles a la intensidad de la coloración, ya que se normalizó en contra de la intensidad total de píxeles, por lo que pueden ser empleados cuando la tinción de un antígeno es más fuerte que el otro. </li><li> Superponen R coeficiente de acuerdo a Manders 5,6 representa el verdadero grado de colocalización, es decir, el número de píxeles que colocalise en comparación con el número total de píxeles. </li><li> Por otro lado, el coeficiente de colocalización, Mi, describe la contribución de la fluorescencia de la fracción más abundante (en este caso α-actinina, verde) a la fracción menos abundante (en este caso las bacterias, de color rojo), es decir, el número de píxeles de color rojo que se superponen con los píxeles verdes en comparación con el número total de píxeles de color rojo. </li><li> Coeficientes Manders rango entre 1 y 0, siendo 1 la colocalización de alta, 0 ninguno de ellos está, pero que puede ser expresado como porcentaje de fácil interpretación. </li></ol></li><li> Estadísticas de exportación de los valores de un documento de Excel para la presentación de los datos. </li></ol> 4. Resultados representante Localización intracelular de OPC expresa la Neisseria meningitidis y α-actinina Imagen confocal de cerebro humano las células endoteliales microvasculares infectados con Nm de 3 y 8 horas como se describe anteriormente indicado colocalización de α-actinina y Nm que parecía ser menos frecuentes en los tres experimentos de infección h (no se muestra), en comparación con los cultivos infectados durante 8 horas ( Figura 1 AF). A colocalización demostrable de α-actinina con OPC que expresan los meningococos se observó cada vez en&gt; 5 replicar los experimentos. El análisis estadístico de la colocalización con varias imágenes de confocal se llevó a cabo como se describió anteriormente. En general, en HBMEC infectadas con el OPC-expresando meningococos,&gt; la superposición del 25% de la luz verde (α-actinina) y los píxeles de color rojo (Nm) se obtuvo (Figura 2B, superposición coeficiente R). En contraste con la α-actinina, experimentos en los que se llevó a cabo el etiquetado de las bacterias internalizadas y, o bien de actina y vimentina, colocalización ocasionalmente se observó con la actina, pero que con vimentina fue rara (Figure. 2B). Los datos también fueron analizados utilizando el coeficiente de mi, que tiene en cuenta la abundancia relativa de cada fracción. Mi es una medida de la frecuencia de aparición de la señal más abundante (en este caso verde, α-actinina) cada vez que la señal menos abundante (en este caso de color rojo, las bacterias) se produce. Esta medida muestra un nivel notable de ocurrencia de α-actinina en las inmediaciones de interiorizado meningococos (Figura 2A y C). <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Láser confocal de microscopía de barrido para evaluar las interacciones intracelulares de N. meningitidis con α-actinina. AH. Confluente monocapas endoteliales cultivadas en cubreobjetos fueron infectadas con el OPC-expresa (AF) N. meningitidis. Después de 8 horas, las bacterias no adherentes se lavaron las células fijadas con paraformaldehído y permeabilizadas con Triton 0.1% X-100. Posteriormente, las bacterias y α-actinina se tiñeron como se describió anteriormente (α-actinina, verde, bacterias, rojo). AC. Un campo que muestra imágenes de xy la ubicación de Nm (A) o α-actinina (B). La superposición de imágenes en (C) indica que varias regiones en las que el color amarillo-naranja parece sugerir colocalización. Las flechas en (A) y (B) muestran las regiones donde un alto grado de α-actinina acumulación parece haber ocurrido alrededor de las bacterias. D. óptico disección de una colocalización monocapa infectada HBMEC indicando alrededor de las bacterias intracelulares ubicado en la base de una célula. Una vez más, esta colocalización no es accidental debido a la proximidad de la α-actinina, como el general mancha de α-actinina en esta región es baja. E y F. Las imágenes tridimensionales de las personas infectadas monocapas HBMEC procesados ​​que el anterior. Una vista oblicua de la superficie apical (E) muestra las bacterias adheridas teñido de rojo (flecha roja), mientras que varias bacterias situada hacia la superficie basal de las células endoteliales (flecha amarilla) son claramente de color naranja / amarillo. Ubicación basal se puede ver más claramente en (F), que es un fin-de XZ sección transversal. G. Una imagen de microscopio electrónico de tinción negativa de N. meningitidis que muestra sudiplococos predominantes. Cada coco es de aproximadamente 0,5 m de diámetro. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La localización y distribución de α-actinina, la actina y vimentina en las células HBMEC. Monocapas infectadas de A. HBMEC fueron tratados como se describe en la leyenda anterior, pero además de la α-actinina, un cubreobjetos fueron utilizados para la detección de la actina y vimentina mediante procedimiento similar al de la α-actinina. Como el anterior, α-actinina concentra en torno a varias bacterias internalizadas (flechas blancas). Vimentina y actina no colocalise con las bacterias a niveles apreciables. Barra representa 20 micras. B. y C. Los valores de los coeficientes R y mi fueron obtenidos de más de tres experimentos utilizando el software Volocity como se describió anteriormente.

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	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

La posibilidad de unión de interiorizado OPC expresa la Neisseria meningitidis de α-actinina se exploró mediante HBMEC por el examen de la colocalización de la bacteria y la proteína del citoesqueleto de las células infectadas después de 3 y 8 período de incubación. Por microscopía confocal, la colocalización de Neisseria meningitidis con α-actinina se pudo demostrar. Cabe destacar que, aunque las bacterias se interiorizaron a las 3 h, se produjo poco colocalización con α-actinina en este punto del tiempo. Asociación de bacterias con la proteína del citoesqueleto parece requerir un largo período de residencia intracelular después de 8 h tiempo de infección, un número significativo de bacterias había α-actinina, aparentemente, en estrecha colaboración. Alfa-actinina es una proteína multifuncional, y las interacciones bacterianas con el elemento del citoesqueleto podría tener una influencia significativa en la función de las células diana, que es un tema de los estudios actuales. Cuantificación de la colocalización como se describió anteriormente requiere una meticulosa preparación de la muestra. Se debe prestar especial atención a la fijación de la muestra, el bloqueo de las diluciones de época y de anticuerpos. Para obtener la mejor relación señal-ruido, cada anticuerpo primario y secundario deben ser valorados en experimentos preliminares para determinar las concentraciones óptimas. En nuestra experiencia, el medio de montaje Mowiol produce mejores imágenes.

1. Láser confocal de microscopía de barrido (CLSM): Leica SP5 confocal sistema de imagen: Este sistema, mediante el uso de una combinación de AOTF (acústico-ópticos filtro sintonizable) y AOBS un (acústico-óptico divisor de haz), simplifica la excitación con longitudes de onda específicas. 2-Software: Confocal Leica software LCS, Leica Microsystems, Alemania. Volocity 5, la improvisación, PerkinElmer, EE.UU..

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

La proteína Opc de Neisseria meningitidis (Nm, meningococo) es una proteína expresada en la superficie integral de membrana externa, que puede actuar como una adhesina y un invasina eficaz para las células epiteliales y endoteliales. Hemos identificado encuentra en la superficie endotelial integrinas como receptores principales de OPC, un proceso que requiere Opc para unirse primero a ligandos de integrinas como la vitronectina y a través de estos a las células expresan receptores 1. Este proceso conduce a la invasión bacteriana de las células endoteliales 2. Más recientemente, se observó una interacción de OPC con una proteína 100kDa en lisados ​​de células enteras de células humanas 3. Inicialmente se observó esta interacción cuando las proteínas de la célula huésped separados por electroforesis y se transfirieron a nitrocelulosa se superpone con el OPC-expresando Nm. La interacción es directa y no implican moléculas intermedias. Por espectrometría de masas, hemos establecido la identidad de la proteína como α-actinina. Como no hay superficie expresada α-actinina se encontró en ninguna de las ocho líneas celulares examinadas y, en las interacciones OPC con las células endoteliales en la presencia de plomo en suero a la entrada de bacterias en las células diana, se analizó la posibilidad de que las dos proteínas que interactúan intracelularmente. Para ello, cultivan el cerebro humano las células endoteliales microvasculares (HBMECs) estaban infectados con el OPC-expresando Nm durante largos períodos y los lugares de bacterias internalizadas y α-actinina fueron examinadas por microscopía confocal. Hemos observado en función del tiempo de aumento de la colocalización Nm con la proteína del citoesqueleto, que fue considerable después de un periodo de ocho horas de la internalización de las bacterias. Además, el uso de software de imagen cuantitativa nos permitió obtener una medida relativa de la colocalización de Nm con α-actinina y otras proteínas del citoesqueleto. Aquí se presenta un protocolo para la visualización y cuantificación de la colocalización de la bacteria con las proteínas intracelulares después de la entrada de bacterias en las células endoteliales humanas, aunque el procedimiento es también aplicable a las células epiteliales humanas.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), una gram negativos humanos específicos de patógenos respiratorios, se puede unir a humanos α-actinina. Aquí se presenta un protocolo para la visualización de la colocalización de la bacteria intracelular de α-actinina después de la entrada de bacterias en las células endoteliales microvasculares cerebrales (HBMECs).

La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K vistas.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), una gram negativos humanos específicos de patógenos respiratorios, se puede unir a humanos α-actinina. Aquí se presenta un protocolo para la visualización de la colocalización de la bacteria intracelular de α-actinina después de la entrada de bacterias en las células endoteliales microvasculares cerebrales (HBMECs).

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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Investigación

Inmunología e Infección

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Sondas de detección óptica de novela bacterias específicas en el tejido de pulmón humano Ex Vivo por láser Confocal Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...