El análisis de acoplamiento de imágenes de una sola mancha y la fuerza de tracción microscópica puede analizar maquinarias moleculares para el avance y la navegación del cono de crecimiento. Como las técnicas utilizan materiales disponibles comercialmente y microscopios estándar. Los investigadores pueden adaptarse literalmente a las técnicas de sus estudios.
Comience por tratar las neuronas con tetrametil-rodamina o ligando TMR a una dilución de uno a 2000 en medio de cultivo en el día in vitro 3. Luego mantenga las neuronas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora. Después de la incubación, lave el ligando TMR tres veces con PBS precalentado.
Retire el PBS antes de agregar 0,5 mililitros de medio L-15 de Leibovitz calentado en las neuronas. Mantenga las neuronas a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, encienda un microscopio de epifluorescencia y ajuste la incubadora superior del estado a 37 grados centígrados.
Luego, coloque las neuronas tratadas con ligando TMR en el plato inferior de vidrio en la incubadora superior del escenario calentado. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes, como el tiempo de exposición en 500 milisegundos para un canal de fluorescencia Lifeact y HaloTag-actina y el binning como 0,065 micras por 0,065 micras por píxel en un intervalo de tiempo de tres segundos durante 50 fotogramas. Después de seleccionar un cono de crecimiento que expresa fuertemente Lifeact y semanalmente expresa HaloTag-actina.
Cierre el campo en el diafragma para iluminar un área mínima que incluya el cono de crecimiento y adquiera imágenes de lapso de tiempo. En el día in vitro 3, reemplace el medio de cultivo con 0,5 mililitros de medio L-15 de Leibovitz calentado y mantenga las neuronas durante una hora a 37 grados centígrados. Para la microscopía de fuerza de tracción, encienda un microscopio confocal de barrido láser y ajuste la incubadora superior del escenario a 37 grados centígrados.
Coloque las neuronas en el plato inferior de vidrio en la incubadora superior de etapa preadvertida. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes como se describe en el script de menú y seleccione un cono de crecimiento que exprese fuertemente la proteína de fluorescencia verde mejorada o EGFP. Concéntrese en la superficie del gel y adquiera imágenes de lapso de tiempo.
Cuando haya terminado, utilice un software de procesamiento de imágenes para producir pilas de imágenes RGB de lapsos de tiempo de un solo canal. A continuación, guarde las imágenes como archivos tiff. A continuación, aplique 100 microlitros de 10% en peso por volumen de dodecil sulfato de sodio o SDS disuelto en agua destilada al plato con fondo de vidrio para relajar el sustrato del gel liberando neuronas del sustrato.
Luego incube el plato en la incubadora superior del escenario durante cinco minutos a 37 grados centígrados para estabilizar la temperatura. En el microscopio confocal de barrido láser, concéntrese en la superficie del gel para adquirir una imagen de las perlas en el sustrato no forzado. Produzca una imagen RGB de un solo canal de las cuentas en el sustrato sin restricciones y guarde esta imagen como un archivo tiff.
Descargue el código de análisis de fuerza de tracción TFM2021 y abra TFM2021 en MATLAB. Abrir principal. m en TFM2021 y ejecutarlo.
Cuando aparece una interfaz gráfica de usuario en la pantalla. Haga clic en cargar imagen de sustrato sin entrenar y seleccione la imagen de cuenta corregida de posición X-Y en el sustrato sin forzar. Vaya a cargar imágenes de cuentas fluorescentes y seleccione la pila de lapso de tiempo de cuentas de imagen.
Luego haga clic en cargar imágenes de campo brillante para elegir la imagen de pila de lapso de tiempo de campo brillante y use cargar imágenes GFP para seleccionar la imagen de pila de lapso de tiempo de EGFP. En la lista desplegable de la interfaz gráfica de usuario, seleccione GFP antes de hacer clic en ROI para especificar la región rectangular de interés, incluido el cono de crecimiento, haciendo clic en dos puntos de la imagen de celda mostrada. Una vez hecho esto, haga clic en el botón Guardar en la interfaz gráfica de usuario para guardar las imágenes de pila seleccionadas junto con el ROI en un archivo mat.
A continuación, haga clic en detectar en el lugar e ingrese el valor deseado en el cuadro de diálogo para determinar un umbral para la detección de cuentas. Presione OK para comenzar el cálculo. Después de finalizar el cálculo, haga clic en trazar pista para ampliar la región seleccionada anteriormente y mostrar las cuentas detectadas como puntos blancos.
Utilice cuentas seleccionadas para demarcar una región poligonal que incluya los puntos correctos debajo del cono de crecimiento. Luego, al presionar enter en el teclado, los puntos blancos dentro de la región poligonal cambiarán a rojo. Haga clic en estimar la fuerza en la interfaz gráfica de usuario.
Luego ingrese valores para el tamaño de píxel y el módulo de Young como se explica en el manuscrito. Ponga el valor de la relación de Poisson como 0.3 y ejecute la fuerza de estimación para iniciar el cálculo. El software guardará los resultados del cálculo en un archivo de formato de hoja de cálculo.
Las imágenes de fluorescencia de un cono de crecimiento neuronal mostraron una alta expresión de Lifeact que permite la visualización de la morfología del cono de crecimiento bajo un diafragma completamente abierto y estrecho. Los niveles de expresión de HaloTag-actina fueron muy bajos con señales tenues. Cuando el diafragma se estrecha adecuadamente, las señales de fondo disminuyen y aparecen un solo acto en las manchas en el cono de crecimiento.
Los investigadores que logren adecuadamente todos los pasos observarán el flujo retrógrado de F-actina en el cono de crecimiento. La rigidez del gel de poliacrilamida se determinó calculando la profundidad de la hendidura causada por el peso de la microesfera. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser para capturar imágenes de la superficie del gel y el fondo de la microesfera.
Las señales de las perlas fluorescentes no eran visibles en la superficie del gel en la región con sangría. Las imágenes de fluorescencia de las perlas incrustadas en el gel de poliacrilamida y el cono de crecimiento neural, mostraron las perlas en su origen y posiciones desplazadas. También se observó la señal EGFP del cono de crecimiento.
Los kymographs mostraban los movimientos de la cuenta en comparación con una cuenta de referencia. Al realizar una sola imagen de motas, es importante seleccionar una neurona que exprese semanalmente cómo actuar bajo dos un área mínima. Al realizar una microscopía de fuerza de tracción, las imágenes de alto aumento son importantes para una concentración precisa de la fuerza de tracción.
