Çalışmalar Wellcome Trust ve Menenjit UK tarafından finanse edilmiştir. HBMEC hücre hattı Dr. KS Kim tarafından sağlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve elektron mikroskobu Wolfson bio Tesisi, University of Bristol yapıldı. Bay Alan Leard Dr Mark Jepson (University of Bristol), ve Sayın Alan Tilley (Perkin Elmer) Biz de onların yardım ve tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.

1. İmmünofloresan Protokolü Tohumculuk, Enfeksiyon ve immüno-boyama Aşağıdaki yordamlar, uygun güvenlik düzeyi doku kültürü ve mikrobiyolojik laboratuvar olanakları gerektirir. 1. GÜN A. enfeksiyon için hedef hücreler hazırlanması <ol><li> Tohum HBMECs cam lamelleri% 50 izdiham (~ 1.5x10 4 hücre / cm 2) (16 mm çapında), 12 plaka (iyi 3,8 cm 2 büyüme alanı /) içine yerleştirilir . Büyüme orta: RPMI 1640% 15 ısı ile inaktive edilmiş (56 ° C, 30dk) FBS, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin / streptomisin,% 1 (v / v) MEM elzem olmayan bir amino ile desteklenmiş asitler çözüm ve% 1 MEM vitaminleri çözüm. </li><li> 37 ° C gecelik (O / N) üzerinde Kültür,% 5 CO2 inkübatör. </li></ol> B. Bakteriyel kültürü <ol><li> 37% 10 ısıtılmış at kanı ile takviye gerekli orta örneğin Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) agar plaklarına faiz yükü büyümeye O / N% 5 CO 2 atmosfer 4 ° C (16-18 saat). </li></ol> 2. GÜN A. Of Bakteriyel (N. meningitidis) Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 10 mcL kültür döngüsü kullanarak, 2 mL PBSB (kalsiyum ve magnezyum ile PBS) gecelik bakteri kültürünün bir süspansiyon olun. </li><li> Büyük bakteriyel büyüklükler oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca stand süspansiyon bırakarak yerleşmek için izin verin. </li><li> Pelet bozmadan, steril bir tüpe süspansiyon üst 1 ml (hisse senedi inokulum) aktarın. </li><li> Stok inokulum bakteri sayıları tahmin etmek için, 1 ml hacimli 0.1M NaOH% 1 SDS içeren tüplere alikotları (20-50 mcL) ekleyin ve hafifçe karıştırın çözünebilmesi. </li><li> 260nm (A260) absorbans belirleyerek çözüm nükleik asit içeriği ölçün. Bizim ellerde, 1 tekabül A260 5x10 8 koloni birimleri şekillendirme / ml (kob / ml). Bu PBSB stok inokulum dilüsyonları bir dizi hazırlamak agar plakaları üzerinde kaplama ve O / N inkübasyondan sonra koloniler sayma kontrol edilebilir. </li><li> Enfeksiyon orta stok inokulum bir kısım sulandırınız [decomplemented (% 2 ile desteklenmiş M199 (56 ° C, 30dk) normal insan serumu (NHS)], hedef hücreleri enfeksiyon için gerekli olan bakteri yoğunluğu elde etmek için. <ol><li> Laboratuvarımızda, hedef hücre başına 200-300 bakteri enfeksiyon oranı rutin kullanılır. </li></ol></li></ol> B. Hücre Kültürü Enfeksiyonu <ol><li> Kültürlü hedef hücreleri 3 kez antibiyotiklerin herhangi bir iz kaldırmak için Hank orta lamelleri yıkayın. </li><li> % 5 CO 2, 3 saat 8 saat 37 taze hazırlanmış bakteri süspansiyonları (yukarıda açıklandığı gibi) ° C ile hücreleri enfekte. </li><li> Enfeksiyon döneminin sonunda, 4, 30-45 dakika süreyle RT veya O / N% 2 paraformaldehid 500 mcL (PFA) hücreleri PBS ile üç defa yıkamak ve düzeltmek ° C <ol><li> Yukarıda gösterilen konsantrasyon ve saatte Paraformaldehit fiksasyon, bakteriyel ve hücresel morfoloji korunması için uygun olduğu tespit edilmiştir. </li></ol></li><li> Paraformaldehid kapalı yıkadıktan sonra,% 0.1 Triton X-100 10 dakika süreyle PBS içinde seyreltilmesi kuluçka tarafından paraformaldehid sabit hücreler permeabilise. </li><li> Örnekleri PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Immüno-boyama geçin veya alternatif olarak, 4,% 1 BSA / PBST O / N 500 mcL örnekleri terk ° C </li></ol> 3. GÜN Immüno-boyama Hücre içi bakteri boyama ve aşağıdaki gibi α-aktinin uygun birincil ve ikincil antikor kullanımı ile sırayla veya aynı anda yapılabilir; tüm işlemleri 12 kuyucuğu yapılabilir. <ol><li> Blok 500 mcL% 3 ile permeabilised hücreleri içeren lamelleri RT 30-60 dakika BSA / PBST (PBS Triton X-100% 0.05 içeren) </li><li> PBS ile yıkadıktan sonra, 12 plaka her lamel yeni bir kuru, iyi transfer. </li><li> Bakteri ve α-aktinin karşı primer antikor ekleyin; lamel yüzeyini kapsayacak şekilde dikkatlice ilave seksen 100 mcL lamel ortalama antikor yeterli olacaktır. 1s için oda sıcaklığında inkübe edin. <ol><li> Biz aynı anda α-aktinin (Abcam) karşı Neisseria meningitidis (laboratuar kaldırılan) ve fare monoklonal antikor (mAb) karşı tavşan poliklonal antiserum kullanılır. Bazı deneylerde, anti-α-aktinin yerine, aktin ve vimentin karşı mAb (Sigma) kullanıldı. </li></ol></li><li> Inkübasyon sonunda, iyi PBS 200 mcL eklemek için yeni bir de içeren 500 mcL PBS lamel ve yer kaldırın. </li><li> 5 dakika sonra, pipetleme tarafından PBS çıkarın ve sonra taze PBS ekleyin. Iki kez tekrarlayın. Lamelleri bir aktarınyeni kuru kuyu. </li><li> Karanlıkta 1s için oda sıcaklığında inkübe;% 1 BSA / PBST seyreltilmiş farklı fluorochromes konjuge uygun sekonder antikor ekleyin. <ol><li> Bakteriyel tespiti için, biz TRITC ile konjuge anti-tavşan Ig kullanılan ve α-aktinin ve diğer iskelet protein tespiti için, konjuge anti-fare Ig kullanılan ya FITC (Sigma) veya Alexa Fluor 488 - (Invitrogen). </li></ol></li><li> Inkübasyon sonunda, 4 ve 5. adımları olarak yıkayın. </li><li> Sayaç karanlık RT az 5 dakika için 0.6 mg / ml PBS içinde DAPI (DNA leke) ile leke. </li><li> PBS ile durulayın. </li><li> Montaj orta bir damla slaytlar (e, g. Mowiol veya Vectashield) Mount lamelleri (hücreleri aşağı bakacak şekilde) </li><li> 4 ° C karanlıkta saklayın </li><li> Örnekler mikroskop altında gözlem için hazır. </li></ol> 2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) Gözlemlemek ve hücre içi bakteri ve iskelet elemanları görüntülerini yakalamak için, Leica DM I6000 ters Epifloresans mikroskop bağlı bir Leica SP5-Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak immunolabelled örnekleri ve çekilen görüntülerin kullandı. Tüm görüntüleri Leica yazılımı ile 63x NA 1.4 yağ daldırma amaç ve süreci kullanılarak toplanmıştır. CLSM prosedürü: <ol><li> CLSM prosedürü başlatmak için, objektif bir damla immersiyon yağı ekleyin ve mikroskop aşamasında örnek slayt, lamel-yüzü aşağı yerleştirin. </li><li> Mikroskop görsel moduna ayarlayın ve mikroskop göz parçaları kullanılarak ilgi alanı bulmak. </li><li> Leica Yazılım kullanarak, xyz satın alma modunu seçin. </li><li> 512 x 512 formatında (kare boyutu) seçin. Colocalisation çalışmalar için, yüksek çözünürlük, daha doğru görüntü; mikroskop çözünürlük sınırı göz önünde tutmak. Daha sonra çift yönlü X modunda, tarama hızı artacak seçin ve fotoğraf beyazlatma azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Sıralı tarama ayarlarını ayarlayın. &quot;Sıra&quot; fonksiyonu tıklayın ve tarama modlarından birini seçin. Biz modu &quot;satırları arasındaki&quot; kullanabilirsiniz. </li><li> DAPI (mavi), Alexa Fluor TRITC için 488 (yeşil) ve 561 nm (kırmızı) için 488 nm 405 nm: Seçiniz lazer sekonder antikor konjuge fluorochromes göre kirişler. Photomultiplier Tube (PMT) sırasıyla 1, 2, ve 3 etkinleştirin. Doğru emisyon dalga boyu algılamak için PMT ayarlarını yapın. </li><li> Z yığınları veya seri (&quot;başlamak&quot;) üst ve alt (&quot;son&quot;) ayarlayın. Sonra, gerekli &quot;z adım boyutu&quot; olarak ayarlayın. <ol><li> Neisseria meningitidis bir Diplococcus (Şekil 1G) ve her coccus yaklaşık çapı 0.5 mm yana, 0.20 mm z-adım boyutu en az iki kez her coccus tarama olasılığını artırmak için seçildi. 0.2 mm - 0.1 optimum çözümü için adım boyutu içinde de. </li></ol></li><li> Sinyal gürültü oranı artırmak için 3 hat ortalama seçerek son tarama parametrelerini ayarlayın. </li><li> &quot;Start&quot; tuşuna tıklayarak, çift ya da üçlü lekeli görüntüler farklı dalga boylarında farklı kromoforlar arasında çapraz tartışma ortadan kaldırmak için sıralı tarama elde edilir. </li><li> Iki fluorochromes colocalisation bir göstergesi için seçilen kanallar tek bir görüntü birleştirme &quot;overlay&quot; fonksiyonu seçin, örneğin, Alexa 488 (yeşil) ve (kırmızı) TRITC fluorochromes hem colocalise zaman, sarı renk kaplanan görüntü görünecektir . </li><li> Z yığınları veya seri mümkün colocalisation görselleştirmek için gerekli bir 2B görüntü yapımı için &quot;maksimum projeksiyon&quot; fonksiyonunu kullanarak derleyin. Colocalisation daha detaylı analiz, her optik bölümün analizi ile elde edilebilir. </li><li> Z yığınları veya seri aldıktan sonra, çeşitli unsurları içi lokalizasyonu (Şekil 1E) görselleştirilmesi için dik bir görüntü elde etmek için verileri işlemek. </li></ol> 3. Colocalisation, ölçümü İstatistiksel analizler konfokal tarama mikroskobu görüntüleri Volocity yazılım (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Bu yazılım Manders ve ark (1993) 5 açıklandığı gibi colocalisation analiz için özel olarak tasarlanmış bir araç sağlar. Colocalisation dijital floresan görüntüleme bağlamında her kanalda aynı voksel (piksel hacmi) yerde bir sinyal tespiti olarak tarif edilebilir. Iki kanal aynı örnek alan (Volocity kullanım kılavuzu) alınan iki farklı fluorochromes görüntüler oluşur. İstatistiksel analizler aşağıda açıklanan Kantitatif Colocalisation Analizi Volocity yazılım kullanarak (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Kantitatif Colocalisation Analizi <ol><li> Volocity yazılımı kullanarak CLSM görüntüleri ile bir kütüphane oluşturun. </li><li> Üst çubuktaki görüntü &quot;genişletilmiş odak&quot; ı seçin. Bu araç, analiz edilmesi gereken bir 2B görüntü z yığınları derlemek. </li><li> &quot;Ko&quot; aracını seçin. Analiz edilmesi için iki kanal aynı renk derinliğine sahip olmalıdır. </li><li> Sayısallaştırılmış olacak bu bölgeyi seçin. Herhangi bir arka plan çıkarmak için eşik değerlerini ayarlayın. </li><li> &quot;Ko oluşturmak&quot; seçerek colocalisation çıktı oluşturun. Colocalisation istatistikler, daha önce seçilen ilgi bölgeler için oluşturulur. </li><li> Seç Manders &#39;katsayıları R (üst üste katsayısı) ve (colocalisation katsayısı). <ol><li> Manders &#39;katsayıları toplam piksel yoğunluğu karşı normalize olarak boyanma yoğunluğu duyarlı değildir; böylece bir antijen boyama diğerinden daha güçlüdür istihdam edilebilir. </li><li> Manders 5,6 katsayısı R bindirme gerçek colocalisation derecesi temsil eder, yani piksel piksel sayısı ile karşılaştırıldığında colocalise sayısı. </li><li> Öte yandan, colocalisation katsayısı, Benim, daha bol benzer parçaları (bu durumda bakterilerin, kırmızı) daha bol benzer parçaları (bu durumda α-aktinin, yeşil) floresan katkı açıklar, yani kırmızı piksel sayısı kırmızı piksel sayısı ile karşılaştırıldığında, yeşil piksel ile örtüşüyor. </li><li> Manders &#39;katsayıları, 1, 0 hiçbiri yüksek colocalisation olan, 1 ve 0 arasında değişir, ancak daha kolay yorumlanması için yüzdesi olarak ifade edilebilir. </li></ol></li><li> Veri sunumu için bir Excel belgesi ihracat istatistikleri değerleri. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Hücre içi yerelleştirme Opc ifade Neisseria meningitidis ve α-aktinin Α-aktinin (gösterilmemiştir), 3 ve 8 saat, 3 saat enfeksiyon deneylerde daha az olduğu ortaya çıktı Nm belirtilen colocalisation yukarıda açıklandığı için Nm ile enfekte insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri Konfokal görüntüleme, 8 saat boyunca enfekte kültürleri ile karşılaştırıldığında ( Şekil 1 AF). Opc ifade Meningokoklar α-aktinin kanıtlanabilir colocalisation&gt; 5 çoğaltmak deneylerde her zaman gözlendi. Yukarıda açıklandığı gibi birkaç konfokal görüntüleri kullanarak colocalisation istatistiksel analizi gerçekleştirildi. Genel olarak, HBMEC ile enfekte Opc-ifade Meningokoklar, yeşil (α-aktinin) ve kırmızı (Nm) piksel&gt;% 25 örtüşme (Şekil 2B, katsayısı R Overlap) elde edildi. Vimentin nadir içselleştirilmiş bakteri ve ya aktin ve vimentin etiketlenmesi yapıldı α-aktinin, deney aksine, zaman zaman colocalisation aktin ama gözlenmiştir (Figure. 2B). Bu veriler de her kısmın göreceli bolluk dikkate alır katsayısı My kullanılarak analiz edildi. Daha bol sinyali (bu durumda yeşil, α-aktinin) daha az bol sinyali (kırmızı, bakteri bu durumda) ortaya her zaman ortaya çıkma sıklığı bir ölçüsüdür. Bu önlem, içselleştirilmiş Meningokok (Şekil 2A ve C) çevresinde α-aktinin, ortaya çarpıcı bir seviyesini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. N. içi etkileşimleri değerlendirmek için Konfokal lazer tarama mikroskopisi α-aktinin ile meningitidis. AH. Lamelleri yetişen konfluent endotel mono tabakaları Opc-ifade (AF) N. ile enfekte olmuş meningitidis. 8 saat sonra, yapışık olmayan bakteriler yıkandı, hücreleri paraformaldehid ile sabit ve% 0.1 Triton X-100 ile permeabilised. Daha sonra, yukarıda açıklandığı gibi bakteri ve α-aktinin (bakteri, kırmızı α-aktinin, yeşil) boyandı. AC. Nm (A) veya α-aktinin (B) yerini xy resimlerini gösteren bir alan. (C) Bindirme görüntüsünün sarı-turuncu renkli colocalisation düşündüren göründüğü çeşitli bölgelerinde gösterir. Oklar (A) ve (B) α-aktinin birikimi yüksek derecede bakterilerin çevresinde meydana gelmiş görünüyor bölgelerde gösterir. D., bir hücrenin üssünde bulunan, hücre içi bakteri çevresinde virüslü bir HBMEC tek tabaka belirten colocalisation Optik diseksiyonu. Yine, bu bölgede genel α-aktinin leke olarak bu colocalisation düşük, α-aktinin yanlışlıkla yakınlığı nedeniyle değildir. E ve F Üç boyutlu görüntüleri, yukarıdaki gibi işlenmiş enfekte HBMEC mono tabakaları. Apikal yüzey (E) oblik bir görünüm yapışkan bakteri gösterir lekeli kırmızı (kırmızı ok) endotel hücreleri (sarı ok) bazal yüzeyler doğru bulunan birkaç bakteri belirgin turuncu / sarı renkli ise. (F) bir son on XZ kesit. Bazal konumu daha net bir şekilde görülebilir. G. N. olumsuz lekeli bir elektron mikroskobu görüntü onun gösteren meningitidisgelen baskın diplococcal. Her coccus çapı yaklaşık 0,5 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. HBMEC hücrelerin yerleri ve α-aktinin, aktin ve vimentin dağıtım. A. HBMEC, Etkilenmiş mono tabakaları efsanesi yukarıda açıklanan ancak α-aktinin için ek olarak, bazı lamelleri α-aktinin için benzer bir prosedür aktin ve vimentin tespiti için kullanılan tedavi edildi. Yukarıdaki gibi, α-aktinin birkaç içselleştirilmiş bakteriler (beyaz oklar) etrafında yoğunlaştı. Vimentin ve aktin kayda değer seviyelere bakteri ile colocalise vermedi. Bar 20 mikron temsil eder. Katsayıları R ve My B. ve C. değerleri üçten fazla deneyler yukarıda açıklandığı gibi Volocity yazılımı kullanılarak elde edilmiştir.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

Bağlayıcı olasılığı içselleştirilmiş Opc HBMEC ifade α-aktinin Neisseria meningitidis bakteri colocalisation muayene ve sitoskeletal 3 ve 8 saat kuluçka süresinden sonra enfekte hücrelerde protein kullanılarak incelendi. Konfokal mikroskopi, Neisseria meningitidis ile α-aktinin colocalisation göstermiştir olabilir. Özellikle, bakteriler 3 saat içselleştirmiş olmasına rağmen, bu zaman noktasında α-aktinin küçük colocalisation vardı. Sitoskeletal protein ile Bakteriyel dernek intrasellüler ikamet 8 saat enfeksiyon döneminden sonra uzun bir süre gerektirir, bakteri sayısının önemli ölçüde yakın ilişki görünüşte α-aktinin vardı. Alfa-aktinin, çok fonksiyonlu bir protein ve sitoskeletal elemanı ile bakteriyel etkileşimleri, mevcut çalışmaların bir konudur hedef hücre fonksiyonu üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Colocalisation Kantitasyonu yukarıda açıklandığı gibi, titiz bir örnek hazırlık gerektirir. Özellikle dikkat süresi ve antikor dilüsyonları engelleme, sabitleme örnek verilmelidir. En iyi sinyal gürültü oranı için optimum konsantrasyonlarını belirlemek için ön deneyler, her birincil ve ikincil antikor titre edilmesi gerekir. Deneyimlerimize göre, montaj orta Mowiol Daha iyi görüntü üretti.

1. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM): Leica SP5 konfokal görüntüleme sistemi: Bu sistem, AOTF bir kombinasyonu (acousto optik arasında ayarlanabilir filtre) ve Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor (acousto optik demeti splitter) kullanarak, belirli dalga boyları ile uyarma kolaylaştırır. 2-Yazılım: Leica konfokal yazılımı LCS, Leica Microsystems, Almanya. Volocity 5, Doğaçlama, Perkin Elmer, ABD.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) Opc protein adhesin ve insan epitel ve endotel hücreleri için etkili bir invasin olarak hareket edebilir bir yüzey ifade ayrılmaz dış membran proteini,. Biz Opc, integrin ligandlar gibi vitronectin olarak ilk bağlamak için Opc gerektiren bir süreç için önemli reseptörleri ve bu hücre ifade reseptörleri 1 ile endotel yüzeyinde bulunan integrinler belirledik. Bu süreç endotel hücreleri bakteri istilası 2 yol açar. Daha yakın zamanda, biz, insan hücrelerinde 3 tüm hücre lizatları bulunan bir 100kDa protein Opc bir etkileşim gözlemlenmiştir . Konak hücre proteinlerinin elektroforezi ile ayrılmış ve nitroselüloz için lekelenen Opc eksprese Nm ile kaplanmış olduğu başlangıçta bu etkileşim gözlenmemiştir. Etkileşim doğrudan ve ara moleküller dahil etmedi. Kütle spektrometresi, α-aktinin olarak protein kimliği kurdu. Α-aktinin, incelenen sekiz hücre hatları herhangi bir ifade ettiği gibi herhangi bir yüzey bulundu, ve hedef hücre içine bakteri girişini serum kurşun varlığında endotel hücreleri ile Opc etkileşimleri gibi, intraselüler etkileşen iki protein olasılığını inceledi. Bunun için, kültürlü insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) ile enfekte Opc uzun süre ve içselleştirilmiş bakteri ve α-aktinin yerleri için Nm ifade konfokal mikroskobu ile incelendi. Biz, bakteriyel internalizasyonunda sekiz saatlik bir süre sonra önemli sitoskeletal protein, Nm colocalisation zamana bağımlı bir artış gözlenmiştir. Buna ek olarak, kantitatif görüntüleme yazılımı kullanımı α-aktinin ve diğer hücre iskeleti proteinleri Nm colocalisation göreceli bir önlem almak için olanak sağladı. Işlem aynı zamanda insan epitel hücreleri için geçerli olmasına rağmen, biz burada, görselleştirme ve bakteriyel insan endotel hücre içine girmesinden sonra hücre içi proteinler bakterinin colocalisation ölçümü için bir protokol mevcut.

Watch this Scientific Journal Video about Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human Î±-actinin by Confocal Imaging at JoVE.com

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &amp;#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

18.0K Görüntüleme.  University of Bristol, UK. Neisseria meningitidis (Nm), gram negatif bir insana özgü solunum patojen, insan α-aktinin bağlayabilirsiniz . Burada insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri (HBMECs) içine bakteriyel girmesinden sonra intraselüler α-aktinin bakterinin colocalisation görselleştirilmesi için bir protokol mevcut.

Video: Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

Roman bakteri özel optik tarama Ex Vivo insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan