LSA y RK son apoyados por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS033506 R37-16 y R01 NS060699-03. MPT fue apoyada por una beca de investigación postdoctoral Sociedad Americana del Cáncer (PF-10-057-01-MPC). El asesoramiento y el conocimiento del Dr. Matthew Lyman y el Dr. Oren Kobiler fueron fundamentales en el diseño de la configuración del microscopio y los métodos de imágenes de células vivas. También extendemos gracias a Neal Barlow y Brian T. Kain de Nikon instrumentos para su asistencia técnica en la adquisición, instalación y funcionamiento del microscopio.

Sección 1 - Condiciones de Control Ambiental para microscopía de fluorescencia en vivo de células <ol><li> 30 min antes de cualquier experimento de imágenes conectar y empieza a calentarse el microscopio etapa superior incubadora. <ol><li> Encienda el microscopio, las fuentes de luz transmitida y epifluorescencia y controles de hardware automatizado. Abra el software de control de microscopio, los elementos de NIS, para conectar con el microscopio y empiece a enfriarse la cámara EM-CCD. </li><li> Coloque la lente más caliente al objetivo correspondiente (60X o 100X de inmersión en aceite) Nota:. Seleccione lente objetivo según el tipo de experimento. El contraste de interferencia diferencial 100X (CID) es mejor para el seguimiento de conjuntos de virión transporte anterógrado mientras que la fase de objetivo 60X es adecuado para visualizar propagación anterógrada. Bajo aumento, objetivos de inmersión no petroleras no requieren una lente más caliente, ya que no entran en contacto directo con la muestra. </li><li> Conecte la etapa superior incubadora en la platina motorizada de mi<html> copio. Asegurar la inserción adecuada que mantenga la muestra está en su lugar. Conecte la línea de aire húmedo desde el control de la incubadora al puerto de entrada de la etapa superior incubadora. </li><li> Encienda la incubadora y la lente de controles más cálidos y ajustar la configuración de temperatura a las condiciones previamente verificados específicos para el objetivo y la muestra que se está fotografiado (véase el debate). </li><li> Abra la válvula de control del 5% de CO 2/95% del depósito atmosférico para dar CO 2 del aire complementado a la etapa superior incubadora. La velocidad de flujo debe estar entre 60 y 80 ml de gas por minuto. Mayor velocidad se traducirá en una amplia muestra de deshidratación a pesar de la cámara de humidificación. </li></ol></li><li> Añadir el aceite de lente objetivo y colocar inmediatamente la cultura que serán fotografiadas a la etapa superior incubadora. </li><li> Permitir el equilibrio de la temperatura en el cultivo durante un mínimo de 10 min. Se prefiere una hora, especialmente para formación de imágenes durante la noche se describe en la Sección 3. </li></ol>ve_title &quot;&gt; Sección 2 - imagen en tiempo real de anterógrada Virion Protocolo de transporte Eventos <ol><li> Seis a ocho horas antes de la imagen, infectar un plato de 35 mm cubreobjetos-parte inferior de maduros, las neuronas SCG disociadas con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012a 11. Si va a probar más de un virus, off-set inoculaciones por 30-60 minutos para permitir la formación de imágenes de muestras secuenciales en similares tiempos después de la infección. </li><li> Inserte plato a la etapa superior incubadora durante un mínimo de 10 minutos antes de ejecutar cualquier experimento. Mientras que la temperatura se equilibre, el plano focal está cambiando y va a afectar negativamente los experimentos de imagen. </li><li> Con luz transmitida y el ocular del microscopio, encontrar un cuerpo celular neuronal que tiene una extensión axonal claramente aislados. También puede utilizar la iluminación fluorescente adecuado para encontrar una célula que expresa deteccióncantidades de mesa de proteínas fluorescentes. Es importante limitar la exposición de la muestra a la iluminación fluorescente, en este paso y pasos subsiguientes, debido a daño celular inducido por la luz y blanqueo de proteínas fluorescentes. </li><li> Atenúa la iluminación de fluorescencia para reducir la intensidad de la luz de excitación a la que están expuestas las células. Involucrar a la luz atenuando densidad neutra (ND) filtros de la trayectoria de la luz de iluminación de fluorescencia. Para las películas que duran más de 1 min, un mínimo de ND4 deben ser usados ​​para prevenir foto-blanqueo de proteínas fluorescentes y extensa foto-daño de los axones. Estructuras altamente fluorescentes normalmente se pueden visualizar con un ND8 filtro en su lugar. </li><li> Utilizando el software de microscopio (Figura 2 y Suplementario Movie 1A), cambiar la trayectoria de la luz a la cámara EM-CCD. </li><li> Determinar tiempos de imagen óptima y las condiciones para cada canal fluorescente. <ol><li> Inicie una ventana de la imagen en vivo mediante el botón &quot;Play&quot;. &lt;/ Li&gt; <li> Determine los ajustes de exposición de cámara óptimos para cada proteína fluorescente. No exceder 300 ms por canal como aberraciones dinámicas sobre los rápidos estructuras virión movimiento ocurrirá. Utilizar la ganancia EM de la cámara a un ajuste de 300 (fabricante sugirió ganancia máxima), para reducir al mínimo el tiempo de exposición y mejorar la detección de señales débiles. Tiempos de exposición correctos deben producir una imagen con una baja intensidad de fondo y de señales de alta específicos. </li></ol></li><li> Después de la determinación de riesgos y la búsqueda de una región bien definida de axón, el software debe ser configurado para realizar la adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo de la muestra para evitar el blanqueo. <ol><li> En el software de elementos NIS, seleccione el 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú &quot;Aplicaciones&quot; del menú desplegable. </li><li> En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora que determinará la frecuencia de adquisición de imágenes. Establezca el intervalo de &quot;Sin demora&quot; y la duración a 5 min. Thsoftware e adquirirá entonces cuadros de imagen a la mayor frecuencia posible duración de 5 min. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Lambda&quot;, que permite la selección de las configuraciones de hardware predeterminados utilizados para la adquisición de imágenes fluorescente múltiple. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable para seleccionar una configuración de hardware apropiada. Repita el procedimiento para todas las proteínas fluorescentes que se va a examinar. </li><li> Asegúrese de que las pestañas de &quot;posiciones XY&quot;, &quot;Z-series&quot; y &quot;agrandar&quot; son de-seleccionados. </li><li> Encima de las pestañas, seleccione la casilla &quot;Guardar en archivo&quot; para guardar automáticamente las imágenes en el disco duro durante la adquisición. Configurar la ubicación y el nombre de archivo del archivo de salida experimento. A medida que se realizan experimentos secuenciales, el software añadirá un número secuencial al final del nombre de archivo designado. </li><li> Una vez que todas las fichas han sido seleccionados. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón &quot;Run-Now&quot;. </li><li> Optimizar la velocidad de adquisición de imágenes a través de los ajustes de exposición y imagtamaño e. Uso de una pequeña región de la zona de imagen-a menudo capaces de acelerar las velocidades de adquisición de marco. Definir la zona de interés con la función ROI en NIS-Elements, seleccionar un área de entre 25% y 50% del área total de la imagen. Por otra parte, los tiempos de exposición más cortos aumentarán las tasas de adquisición de marco, pero disminuye la calidad de la señal (véase el debate). </li></ol></li></ol> Sección 3 - Noche time-lapse de anterógrada Spread Eventos <ol><li> Cuatro horas antes de la imagen, infectar un cultivo neuronal compartimentada construida en un 35 mm μ-plato. Inocular los cuerpos celulares neuronales con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012b 12. </li><li> Coloque suavemente placa de cultivo en la etapa superior incubadora. Asegúrese de que la posición del objetivo se establece en el lado del plato. Lentamente el objetivo en el enfoque, garantición del objetivo no empuja hacia arriba dentro de la muestra. Una vez que el campo de enfoque ha sido identificado, mueva lentamente el objetivo en el centro del plato, cerca de la barrera interna demarcación de la parte interna del compartimiento de axón. Durante el movimiento, asegurar que se mantiene la profundidad de foco y evitar empujando hacia arriba en la muestra. La desviación de la superficie de plástico por el objetivo dañará los axones y el plástico. </li><li> Añadir aproximadamente 2 ml de agua tibia (~ 37 ° C) solución salina tamponada con fosfato a la placa de cultivo fuera del anillo de teflón. Esta rodea la cultura neuronal con un anillo de PBS para reducir al mínimo la deshidratación de la muestra y proporcionar aislamiento térmico. </li><li> Deje que la temperatura se equilibre durante un mínimo de 1 hora antes de iniciar la adquisición de imágenes automatizado (3.8). Pasos 3.5 a través de 3.7 se pueden configurar durante este tiempo. </li><li> Restringir la intensidad de la iluminación al nivel más bajo posible mediante la participación de todos los filtros de densidad neutra. Esto permitirá la adquisición de imágenes frecuentes over períodos de tiempo largos sin excesivo foto-daño. La reducción de la iluminación se traducirá en una señal baja, que requieran exposiciones largas (véase el debate). </li><li> Utilice los ajustes históricos de exposición o antes de montaje experimental generar un plato en paralelo de las células epiteliales infectadas que expresan las proteínas fluorescentes de destino para establecer los ajustes de exposición como se describe en la Sección 2.5. </li><li> Después de ajustar la exposición para los canales necesarios, es el momento de configurar el software de adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo para limitar muestra de blanqueo. <ol><li> En el software de elementos (Figura 2 y la película suplementario 2), seleccione la 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú &quot;Aplicaciones&quot; down menú para abrir la ventana de adquisición ND. </li><li> En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora. Establezca el intervalo de &quot;5 minutos&quot;. Ajuste de la duración de 20 horas. El campo de bucles se calcula automáticamente para el número de repeticiones, el program va a realizar. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Lambda&quot;. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable, seleccione la configuración lambda apropiado para contraste de fase. Repita el procedimiento para las posiciones siguientes, la selección de las configuraciones adecuadas para cada proteína fluorescente a explorar. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;Imagen grande&quot;, que determina los parámetros de varias imágenes que se combinan en un solo campo de visión más amplio. Un área de buen tamaño se compone de 5 x 2 imágenes utilizando un 7% de superposición costura. Esto permitirá que el número máximo de células por posición en ser fotografiado sin afectar la frecuencia de adquisición de la imagen. Además, desactive la casilla de verificación de &quot;Shutter Cerrar activo durante el movimiento Stage&quot;. Esta opción mejora la velocidad de adquisición por parte de no cerrar persianas entre imágenes. </li><li> Seleccione la pestaña &quot;XY posiciones&quot;, para identificar múltiples posiciones que serán secuencialmente fotografiadas en paralelo durante el curso de la película durante la noche. Seleccione las posiciones que definen la po centroint para cada gran área de la imagen. Seleccionar 6-8 posiciones de la imagen en la muestra. Un buen área de la imagen tendrá pequeños grupos de células en estrecha aposición a los axones claramente definidos. Las células no deben ser apilados en la parte superior de cada otra y axón agrupación debería reducirse al mínimo. El punto de enfoque es el núcleo de la célula. Coloque el objetivo de tal manera que una envoltura nuclear se ve claramente definido para la mayoría de las células. </li><li> Asegúrese de que la pestaña de &quot;Z-series&quot; no está seleccionada. </li><li> Configurar la función de guardado automático como se describe en la Sección 2.6.5. </li><li> Prueba de la exposición y la posición haciendo clic &quot;1 bucle de tiempo&quot;. Evaluar las imágenes resultantes para la iluminación de luz transmitida, el enfoque y encuadre. Si el foco se ha desplazado, restablezca el enfoque para cada posición en la pestaña XY. Espere 10 minutos y repita este paso hasta que el enfoque es estable. </li><li> Después de todos los ajustes se han verificado y probado, iniciar el experimento automático haciendo clic en el botón &quot;Ejecutar ahora&quot;. </li></ol></li&gt; </ol> Sección 4 - Procesamiento de Imágenes y Exportación Exportación de datos <ol><li> Los conjuntos de datos obtenidos durante la exploración de células vivas de eventos de transporte o propagación deben ser exportados desde el software de elementos NIS en tipos de archivo más utilizados para su posterior uso en presentaciones y publicaciones (Supplemental Movie 3). Para exportar películas abren la prima nd2 archivo adecuado. Elementos de NIS y seleccione la vista &quot;split-componente&quot; para visualizar los canales fluorescentes deseados. Reproducir el archivo a una velocidad adecuada, a 5 fotogramas por segundo es un buen punto de partida para la visualización de transporte rápido. </li><li> Incluir una indicación de la hora de representar a un reloj en tiempo real durante la reproducción de películas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar Añadir ND-información. Un contador digital aparecerá en la esquina superior izquierda. <ol><li> Edite el sello de tiempo para mostrar la información. Haga clic derecho sobre la barra y seleccione Editar-ND información. En la siguiente ventana emergente, edite el texto para reflejar la imaginaciónng parámetros que son importantes. Editar fuente, el color y el tamaño para mayor claridad. </li></ol></li><li> Vaya al menú &quot;Editar&quot; y encontrar &quot;Crear vista instantánea&quot; o pulse la tecla &quot;x&quot;. Este comando abre la ventana &quot;visión instantánea&quot;. Seleccione &quot;Aplicar a todos los fotogramas&quot; para generar un 8 bits, RGB, archivo listo para exportar que contiene los canales fluorescentes de toda la película. </li><li> Guardar como un archivo. Avi para la compatibilidad multiplataforma. Ajuste la velocidad de reproducción en 200 milisegundos por cuadro. Los archivos. Avi generados por elementos NIS se pueden comprimir más con otro software de conversión en el tipo de archivo deseado. </li></ol>

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No tenemos nada que revelar.

El objetivo de imágenes de células vivas es la observación de los procesos biológicos que ocurren sin una alteración significativa en el acto de la observación. Este objetivo se logra mediante la optimización de tres variables: el control del medio ambiente, la velocidad de formación de imágenes, y la iluminación de fluorescencia. Estas variables interdependientes deben ser equilibradas para lograr condiciones de la imagen viables. Los protocolos presentados utilizan condiciones específicas para producir los ...

La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis. El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un 1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión 3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas 7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína 9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación 12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en 14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje. En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados en sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado 16 y compartimentada 17 (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron en el cultivo in vitro 18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado 6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) 19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con 20 originales o modificadas Campenot cámaras 17 se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral. Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO 2 enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación. Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento. En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones 11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles 12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

Los avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia de células vivas, así como la construcción de cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes han permitido a la visualización en tiempo real del transporte y la propagación de la infección por el virus alphaherpes de las neuronas. La utilidad de las nuevas proteínas de fusión fluorescentes a la membrana viral, tegumento, y cápsidas, en conjunción con imágenes de células vivas, identificado conjuntos de partículas virales transportados dentro de los axones. Herramientas similares se han empleado con éxito para el análisis de la célula-célula repartidas de partículas virales para cuantificar el número y la diversidad de los viriones de transmisión entre las células. Es importante destacar que las técnicas de imágenes de células vivas del transporte y la propagación anterógrada producen una gran cantidad de información, incluyendo velocidades de las partículas de transporte, la distribución de las partículas, y los análisis temporales de la localización de la proteína. Junto a las técnicas genéticas virales clásicos, estas metodologías han proporcionado una visión críticaen importantes cuestiones mecánicas. En este artículo se describe en detalle los métodos de imagen que se desarrollaron para responder a las preguntas básicas de transporte de virus alphaherpes y propagación.

Transporte anterógrado La aplicación de este protocolo para las infecciones de las culturas SCG disociadas con PRV 348, una cepa recombinante PRV expresando GFP-US9 y proteínas de fusión de membrana gM-mCherry, ha facilitado la visualización del transporte anterógrado de viriones (Figura 3 y complementario Movie 4). La incorporación de estas proteínas de fusión en partículas víricas en los resultados de su detección en el transporte de puntos lagrim...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K vistas.  Montana State University. Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Imágenes en vivo en tiempo real de la regeneración de la glándula submandibular del ratón

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor destacado: Estudio de las interacciones entre macrófagos y células epiteliales en la regeneración de glándulas salivales después de una lesión 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...