Apoyado por el NIH R01 HL74082, la Fundación Hartwell, y la Fundación de Cirugía de ultrasonidos.

1. Microburbujas de producción <ol><li> Para preparar la albúmina microburbujas (MB), lugar de una solución al 1% de albúmina de suero en solución salina normal en un frasco con una capa de gas (octafluoropropano) por encima de la fase acuosa. En pocas palabras sonicar la solución (30 segundos) con un desintegrador de ultrasonido equipado con un largo y medio &quot;de la sonda de titanio. Esta formulación es similar a Optison (GE Heathcare), que se presenta en un rango de concentraciones de 0.5 a 1.2 x 10 9 MB / ml. determinar el diámetro medio MB con un contador Coulter Multisizer. El diámetro medio MB albúmina utilizada en este estudio fue 1.93um ± 1.63um. </li><li> Para fabricar MB de lípidos, preparar una dispersión acuosa de 1 mg / ml de polietilenglicol-40 estearato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 2 mg / ml de fosfatidilcolina distearoil (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) y sonciate como ya se ha descritos (1,1) con gas decafluorobutane. Determinar el diámetro medio MB con un contador Coulter Multisizer. El diámetro de lípidos MB media utilizada en este estudio fue 2.01um ± 1.29um. </li></ol> 2. Fabricación de nanopartículas <ol><li> Estos métodos se han adaptado desde el agua en aceite en agua, técnica de emulsión evaporación del disolvente descrito por Davda (2002) y Chappell (2008). </li><li> Preparar un 2% de poli (alcohol vinílico) solución de PVA al disolver 20 g de PVA en 1000 ml de agua desionizada (DI). Permita que la solución para disolver por completo en una placa de agitación durante la noche. Solución se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos y filtrar con un filtro estéril 0.22μm para eliminar cualquier residuo de PVA disuelto. </li><li> Para la fabricación de albúmina sérica bovina (BSA) cargado de poli (láctico-co-glicólico) (PLAGA) nanopartículas (NP), se disuelven 180 mg de destapados 85:15 PLAGA 6 ml en cloruro de metileno (MC) en un vial de centelleo de vidrio. Vortex la solución MC / PLAGA durante 2 minutos. </li><li> Disolver carga deseada (15 mg de BSA) en 1,5 ml de PBS. Añadir la solución de PBS / BSA en dos partes para la solución PLAGA / MC con agitación intermitente. Coloque la solución en hielo durante 5 minutos y ultrasonidos a 45W durante 120 segundos. </li><li> Agregue el MC / PLAGA / carga / solución de PBS a 24ml de 2% de alcohol polivinílico, en dos porciones con agitación intermedia. </li><li> Colocar la solución en hielo durante 5 minutos y ultrasonidos a 45W para 120. </li><li> Mezcle la emulsión NP durante 12 horas en una placa de agitación en una campana de humos para permitir la evaporación de la MC y la estabilización de NP. </li><li> Centrifugar la suspensión por 25 minutos a 20.000 rpm a 4 ° C dos veces para aislar PN y eliminar los restos de PVA. Resuspender el precipitado en 8 ml de agua DI y centrifugar durante 10 minutos a 1000 rmp a 4 ° C para aislar a la población de 100 nm de los parlamentos nacionales. </li><li> Aislar el sobrenadante y el flash se congela a -80 ° C. liofilizar la muestra congelada durante 48 horas. Tienda de las partículas de liofilizado en un desecador a -80 ° C hasta el momento de su uso. </li></ol> 3. Entrega de material compuesto de fabricación de vehículos (Protocolo de Adaptación de VisEn Notas de Química) <ol><li> La conversión de VivoTag680 a la funcionalidad de la superficie carboxi <ol><li> Combinar un vial de VivoTag680 con 50 l de 1,0 M HEPES, pH 7 y anhídrido succínico (2,5 mg, 25 ìmol) en 25 l de DMSO. Añadir 50 l de 1,0 M de NaOH a esta solución, mezcla bien, permita que la solución de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente protegido de la luz. Purificar las partículas con Bio-Rad BioGel (P100, medio) eluyendo con 0,1 M tampón MES, pH 6,0. Recoger la banda verde. </li></ol></li><li> La activación de carboxi-modificado VivoTag680 <ol><li> Combine carboxi-modificado VivoTag680 obtenido en 0,1 M tampón MES, pH 6, con 1 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 2,2 mg de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS). Dejar actuar durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Purificar las partículas activa de agente activador de la Franquicia (EDC) por filtración en gel utilizando Bio-Rad BioGel (P100, medio) eluyendo con 0,1 M tampón MES, pH 6,0 y recoger la banda verde. Inmediatamente conjugar las partículas activadas para aminas que contienen moléculas (por ejemplo, BSA-cargado de nanopartículas). Deje que la solución para reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Amina PN conjugado se purificó a partir de exceso de EDC por centrifugación a 20.000 rpm durante 60 min a 4 ° C, verter el sobrenadante después de centrifugación y resuspensión en 0,1 tampón MES. </li></ol></li><li> Deténgase aquí para fabricar VivoTag680 PN etiquetado para los estudios de administración de fármacos. </li><li> Conjugación de carboxi-modificado PLGA-BSA-VivoTag680 nanopartículas (NP680) para microburbujas de albúmina <ol><li> Combine NP680 obtenido en 0,1 M tampón MES, pH 6 con 1 mg de 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y 2,2 mg de N-hidroxi-sulfosuccinimide (sulfo-NHS). Deje que la solución para reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Purificar las nanopartículas de activar desde el exceso de EDC por centrifugación a 20.000 rpm durante 60 min a 4 ° C, verter el sobrenadante después de centrifugación. Volver a suspender las nanopartículas en el 0,1 tampón MES. </li><li> Lave MB albúmina tres veces en PBS desgasificado para eliminar el exceso de solución de BSA. </li><li> Inmediatamente conjugar las partículas activadas para aminas que contienen moléculas (por ejemplo, microburbujas de albúmina). NP680 permiten una solución de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente. Purificar NP680 microburbujas conjugado (MNCA) de NP680s desatado por lavado tres veces con PBS desgasificado. </li><li> Determinar la concentración de MNCAs utilizando un contador Coulter. </li></ol></li></ol> 4. Tumor Modelo Todos los experimentos con animales se encontraban en el cumplimiento de un protocolo de animales aprobada por la Universidad de Virginia Cuidado de Animales y el empleo. <ol><li> C6 de rata Giloma tumor línea celular fue proporcionada por el Dr. Jason Sheehan de los rayos UVA (Charlottesville, VA). <ol><li> Línea de células se ha probado para asegurar las células se micoplasma libre. </li></ol></li><li> Mantener la línea celular de F-12K mezcla de nutrientes complementado con 16% de suero de caballo, el 3% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de Pen-faringitis, (Gibco, EE.UU.) a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Inocular C57BLJ6/Rag1 ratones (Jackson), con 3 x 10 6 células tumorales C6 Giloma suspendido en 300 l de PBS por vía subcutánea en la extremidad posterior izquierda. Permita que el tumor crezca durante 12 días en llegar a un diámetro máximo de 8-10mm. </li></ol> 5. En aplicación de los ultrasonidos Vivo <ol><li> Anestesiar a los ratones con una inyección combinada intraperitoneal (IP) de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,1 mg / kg de peso corporal) antes del tratamiento. </li><li> Preparar un mantenimiento de la anestesia de clorhidrato de ketamina (20 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,3 mg / kg de peso corporal). Administrar según sea necesario. </li><li> Canular la vena de la cola de cada animal de la vía intravenosa (IV) la administración de un MB, MB / NP o solución MNCA. </li><li> Mediciones del tumor perfusión <ol><li> IV infundir una solución de lípidos MB (1x10 8 MB ​​/ g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%) a una tasa de 15μl/min con una bomba de infusión continua (Harvard Apparatus PHD 2000, Harvard Apparatus, Holliston, MA). </li><li> Un Acuson Sequoia 512 ecografía del sistema (Siemens Medical Solutions, Mountain View, CA) equipado con un 8 13 MHz 15L8 sonda lineal se utilizó en este estudio para cuantificar la perfusión de contraste tumor mejorada. Par la sonda 15L8 al tumor con un gel de ultrasonido a base de agua (Parker Laboratories Aquasonic 100; Parker Laboratorios, Inc., Fairfield, Nueva Jersey). Escanear el tumor en el modo B para obtener el plano de mejor imagen. </li><li> En contraste secuencia de pulsos (CPS) de modo, adquirir una captura de video continuo de intensidad de señal microburbujas 5 segundos antes y después de 20, la gran amplitud &quot;ráfaga&quot; de pulsos a una velocidad de 13Hz. Repetir las mediciones en cuatro planos de imagen. </li><li> Espere diez minutos para infundir MB albúmina e iniciar el tratamiento terapéutico de baja frecuencia para permitir MB de lípidos para borrar de la circulación. </li></ol></li><li> El tratamiento con ultrasonido terapéutico <ol><li> Diez minutos después de las mediciones de perfusión tumoral (5,3) una pareja de diámetro 0,75&#39;&#39;un transductor MHz fuera de foco (A314S; Panametrics, Waltham, MA) a la piel por encima del tumor flanco. IV infusión de albúmina un MB (1 x 10 5 MB / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%), MB / NP (1 x 10 5 MB / g y 0,2 PN ug / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%) o MNCA solución (1 x 10 5 MNCAs / g de peso corporal en 0,3 ml de solución salina al 0,9%). </li><li> Tratamiento de Drogas de entrega <ol><li> Insonar durante sesenta minutos con la secuencia de &quot;1-Burst&quot; pulso (5.4.2.2) durante una infusión continua de los parlamentos nacionales, co-inyección de MB y PN, o MNCAs (5.4.1). </li><li> &quot;1-Burst&quot; secuencia de pulsos consta de 100 sinusoides consecutivos de 1 MHz (ciclo de trabajo = 0,00002) cada uno de pico a pico de 1V de amplitud de un generador de forma de onda (AFG-310, Tektronix, Inc., Beaverton, OR). Amplificar la señal de forma de onda por un RF de 55 dB con un amplificador de potencia (ENI 3100LA, de Industrias Electrónicas de Navegación, Richardson, TX). </li></ol></li><li> El tratamiento ablativo <ol><li> Idéntica a la 5.4.2.1, sin embargo insonar con el &quot;5-Burst-Medio&quot; o &quot;5-Burst - Extended&quot; secuencia de pulsos </li><li> El &quot;5-Burst-Media&quot; secuencia de pulsos consta de 5000 1 sinusoides MHz (ciclo de trabajo = 0,005) cada uno de pico a pico de 1V de amplitud. El &quot;5-Burst-Exteneded&quot; secuencia de pulsos consiste en 10.000 un sinusoides MHz (ciclo de trabajo = 0,01) cada una de 1V pico a pico de la amplitud. </li><li> Durante el curso temporal de la temperatura del monitor experimento tumor mediante la inserción de una aguja termopar (Omega de tipo T, HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2 cm en el tumor. Registrar las mediciones de temperatura cada cinco minutos. </li></ol></li></ol></li><li> Repita las mediciones del tumor de perfusión como se describe en 5.3 diez minutos después del tratamiento terapéutico. </li></ol> 6. La cuantificación de perfusión del tumor <ol><li> Utilizando el programa de CPS en el Sequoia, entrar en el modo ACQ. Seleccione ªe la región de interés que abarca el volumen completo del tumor. Las curvas de la perfusión de recuperación se genera de la forma y = A (1 - e-βt) + C (Sadlowski 2002; Chromas 2001, Yeh 2004) que se ajuste a los datos de la CPS. Evaluar β, una medida relativa de la velocidad de los glóbulos rojos, pre-tratamiento y post-tratamiento. </li><li> Exportación CPS archivos para su análisis fuera de línea. Convertir los datos en archivos avi. Dividen los archivos avi en secuencias de imágenes cuadro por cuadro. Utilizando Compaq Visual Fortan, o un paquete de software similares, generar un tiempo promedio de la imagen de todos los marcos de los impulsos destructivos y 8 segundos después de que el pulso destructiva. </li><li> Para determinar el área del tumor perfusión, utilizando el software ImageJ, apliquen un umbral de 247 a la hora 8 por mordedura de un promedio de imagen CPS y cuantificar los píxeles por ciento mayor en el volumen del tumor. Superposición de la correspondiente imagen en modo B con el tiempo promedio de la imagen un umbral para definir con precisión la zona del tumor. </li><li> Promedio de la zona de perfusión por ciento por un mínimo de cuatro clips de CPS para obtener una zona de perfusión final en un momento determinado punto de un tumor en particular. </li><li> Tomar el producto del área por ciento perfundidos (6,4) y β (0,1) para determinar el flujo de sangre en relación tumor. </li></ol> 7. Biodistribución de nanopartículas en los tumores <ol><li> Doce días antes del tratamiento con la etiqueta fluorescente ratones a cabo PN en una dieta baja alfasprot (Harlan, Indianapolis, IN) para reducir la autofluorescencia causada por la comida normal del ratón cuando la imagen. </li><li> Afeitar el sitio de imágenes (flanco para el hígado) para eliminar todo el pelo. </li><li> Eliminar el vello residual con un agente químico de depilación, como Nair. <ol><li> Enjuague de todos removedor de pelo químicos residuales o una quemadura química puede ocurrir. </li></ol></li><li> Los ratones de imágenes del sistema FMT (VisEn médica) antes del tratamiento y las horas 0, 1, 4, y 24 después del tratamiento como se describe en 5.4.2. </li><li> Antes de anestesiar a los ratones de imágenes con una inyección IP combinación de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg de peso corporal) y xilacina (0,1 mg / kg de peso corporal). Coloque el ratón sobre el cartucho de imagen. Adquirir imágenes de reflectancia de luz blanca y los modos de fluorescentes. Llevar a cabo fluorescentes de imágenes tomográficas en el canal de VT680. </li><li> Emplear la FMT software para generar reconstrucciones en 3D de los datos de imagen que utiliza una ecuación normalizada Born. Después de la reconstrucción, seleccionar volúmenes de interés (VOI) por la elaboración de una región de interés (ROI) en los 3 planos de imagen (X, Y, Z). Un valor medio fluorescentes y el volumen total de VOI y la concentración de fluorocromo, debido al marcado con fluorescencia BSA PN, se generarán para la VOI que abarca los pies y el hígado. </li></ol> 8. Tasa de crecimiento del tumor <ol><li> Evaluar el volumen del tumor mediante la adopción de medidas diarias utilizando calibres digitales. Calcular el volumen del tumor utilizando una aproximación elipsoide, V = 1 / 6 π abc. Donde a, b, c son los diámetros máximo del tumor mide en tres planos ortogonales. </li></ol> 9. Procesamiento y Análisis de tumor <ol><li> Siete días después de la eutanasia a los animales del tratamiento. Canular el ventrículo izquierdo y la sangre exsanguinate con 10 ml de 2% heparinizada Tris Buffer de CaCl2 (0,68 mM) de perfusión, seguido de 10 ml Tris Buffer de CaCl2 (0,68 mM), cada uno durante 10 minutos a 100 mmHg. </li><li> Perfusión tisular arreglar con una infusión de 4% de paraformaldehído en PBS (4 ° C) durante 10 minutos a 100 mmHg. Que la muestra de fijar durante 60 minutos. </li><li> Muestras de los impuestos especiales, insertar en parafina, y cortadas en secciones de 5 micras. </li><li> Realizar estándar de hematoxilina-eosina para evaluar los cambios histológicos que se han producido como consecuencia de la exposición de ultrasonido. </li><li> Para detectar las células apoptóticas, el uso de un terminal transferasa mediado desoxinucleotidil desoxiuridina trifosfato nick fin de etiquetado (TUNEL) ensayo (ApoptTag kit, Intergen Co., Norcross, GA, EE.UU.). </li></ol> 10. Resultados representante 1. Fabricación de nanopartículas (2,0) <ol><li> Si este protocolo es preformado correctamente PN será de forma esférica, según lo determinado por microscopia electrónica de barrido (SEM), y tienen una distribución gaussiana alrededor de 100 nm, según lo determinado por técnicas de dispersión de la luz. Los resultados representativos se muestra en la Figura 1. </li></ol> 2. Drogas dirigido entrega (5.4.1) <ol><li> Con base en los estudios publicados realizados en nuestro laboratorio (canción de 2002, Chappell 2008) y los resultados no publicados presente en la figura 2, los resultados de ultrasonido destrucción de microburbujas en una mejor prestación de nanopartículas intravascular al tejido tumoral. También hemos demostrado que nuestros resultados MNCA técnica de la administración en la entrega de nanopartículas mayor inmediatamente después del tratamiento. </li></ol> 3. La ablación del tumor (5.4.3) <ol><li> Hemos demostrado que la prolongación de la destrucción de microburbujas ultrasónicas, en ciclos de trabajo relativamente bajo (0.005 a 0.01), los resultados de la ablación de la mecánicamicrovasculatura del tumor y la regresión de crecimiento del tumor. Si este protocolo se realiza correctamente se debe esperar cambios en (i) la tasa de crecimiento del tumor (Figura 3), (ii) la hemodinámica del tumor (Figura 4), (iii) área de necrosis y apoptosis (iv). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Caracterización de la figura 1. PLAGA de nanopartículas teniendo BSA. (A) Imagen SEM de las nanopartículas fabricadas correctamente. (B) Imagen SEM de las nanopartículas fabricadas mal. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) de fluorescencia mediada por tomografía computarizada (FMT) imágenes de la ecografía tratados (parte superior) y el control de tratados (parte inferior) por vía subcutánea gliomas inmediatamente después del tratamiento con un MNCAs, donde las nanopartículas (NP) están dando señales de fluorescencia 680 se superponen a escala de grises planas excitación imagen de luz. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cambiar Representante veces en el crecimiento del tumor después de insonación microburbujas con la explosión de cinco protocolo extendido pulso. <img src="/files/ftp_upload/2145/2145fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. B-Mode (A, C) y la ecografía con contraste (B, D) las imágenes de un tumor subcutáneo de glioma C6 en un ratón. En la imagen antes del tratamiento inicial (A) los límites de tumor afecta principalmente hipoecoica se ha trazado en color azul. Mejora promedio de tiempo después de la inyección intravenosa de un agente de contraste se muestra en (B) antes del tratamiento. Después del tratamiento, antes de la inyección de contraste, el tumor es de nuevo la mayoría hipoecoica (D). Después de la inyección de contraste, se mejora significativamente menor en el tumor.

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Los pasos críticos La canulación de la vena del ratón de cola: Inyección intravenosa en la vena de la cola del ratón puede ser un procedimiento difícil. Sin embargo, un catéter de vena de la cola puede mejorar la probabilidad de que una inyección de éxito. Para hacer que el catéter, en repetidas ocasiones doblan hacia atrás y adelante una aguja de calibre 25 hasta que se rompe desde el centro. Inserte el extremo romo en el extremo del tubo de PE 20 y sellar...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ApoptTag kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intergen Co.</td>
<td>S7110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lakeshore Biomaterials</td>
<td>Custom</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vivo Tag 680</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VisEn Medical</td>
<td>10120</td>
<td>Used to Tag BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>363136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MicroTip Sonicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Misonix</td>
<td>S-4000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sequoia</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Simons Medical</td>
<td>P.O.A</td>
<td>Equipped with CPS </td>
</tr>
<tr>
<td>FreeZone 2.5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labconco</td>
<td>7670020</td>
<td>Equipped with Nitrogen Trap</td>
</tr>
<tr>
<td>Methylene chloride (CH2Cl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>D37-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FMT 250</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VisEn Medical</td>
<td>P.O.A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F-12K Nutrient Mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21127-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>polyethyleneglycol-40 stearate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical </td>
<td>9004-99-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>distearoyl phosphatidylcholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>770365</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multisizer Coulter Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter </td>
<td>P.O.A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Waveform Generator </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tektronix, Inc.</td>
<td>AFG-310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>water-based ultrasound gel </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker Laboratories</td>
<td>Aquasonic 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infusion pump </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>Harvard Apparatus PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce Biotechnology</td>
<td>25952-53-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce Biotechnology</td>
<td>106627-54-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Succinic anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>603902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Amplifier </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electronic Navigation Industries</td>
<td>ENI 3100LA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Thermocouple Probe </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioGel (P100, medium)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>150-4170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.75&#x2019;&#x2019; diameter 1 MHz unfocused transducer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Panametrics</td>
<td>A314S </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

contrast ultrasound targeted treatment of gliomas in mice via drug-bearing nanoparticle delivery and microvascular ablation

Estamos desarrollando mínimamente invasiva del agente de contraste de microburbujas enfoques basados ​​en la terapéutica en la que se controla la permeabilización y / o la ablación de la microvasculatura de diversos parámetros de ultrasonido pulsante. En concreto, se están probando si estos enfoques pueden ser utilizados para el tratamiento de tumores cerebrales malignos a través de la administración de fármacos y la ablación microvascular. Los estudios preliminares se han realizado para determinar si el objetivo de drogas de soporte de la entrega de nanopartículas puede ser facilitado por la destrucción mediada por ultrasonido de los agentes &quot;compuesto&quot; de entrega consta de 100 nm de poli (láctico-co-glicólico) (PLAGA) nanopartículas que se adhieren a la albúmina microburbujas cáscara . Denotamos estos agentes como agentes de las nanopartículas de microburbujas-compuesto (MNCAs). Cuando se dirige a los gliomas C6 subcutánea con una ecografía, se observó un inmediato aumento de 4,6 veces en la entrega de las nanopartículas en los tumores MNCA tratado a más de los tumores tratados con microburbujas se administra conjuntamente con las nanopartículas y un aumento de 8,5 veces más que los tumores no tratados. Además, en muchas aplicaciones de cáncer, creemos que puede ser conveniente para llevar a cabo la entrega de fármacos en combinación con la ablación de la microcirculación del tumor, lo que conducirá a la hipoxia tumoral y la apoptosis. Con este fin, hemos probado la eficacia de la no theramal cavitación inducida por la ablación microvascular, demostrando que este método provoca la reducción de la perfusión del tumor, la apoptosis, la inhibición del crecimiento significativo, y necrosis. En conjunto, estos resultados indican que los ultrasonidos dirigidos enfoque tiene el potencial para aumentar la eficacia terapéutica mediante la creación de necrosis tumoral a través de la ablación microvascular y / o mejorando simultáneamente la carga de drogas en los gliomas.

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

Insonación de microburbujas es una estrategia prometedora para la ablación del tumor en un promedio de reducción de tiempo de potencias acústicas, así como para la distribución selectiva de la terapéutica. El propósito del presente estudio es desarrollar estrategias de ultrasonido de baja deber ciclo de pulsación y nanotransportadores para maximizar no de ablación térmica microvascular y la entrega a la carga por vía subcutánea C6 gliomas.

Ecografía de contraste dirigidos tratamiento de los gliomas en ratones a través de la entrega de nanopartículas de drogas y la ablación Teniendo microvascular

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

contrast-ultrasound-targeted-treatment-gliomas-mice-via-drug-bearing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.8K vistas.  University of Virginia. Insonación de microburbujas es una estrategia prometedora para la ablación del tumor en un promedio de reducción de tiempo de potencias acústicas, así como para la distribución selectiva de la terapéutica. El propósito del presente estudio es desarrollar estrategias de ultrasonido de baja deber ciclo de pulsación y nanotransportadores para maximizar no de ablación térmica microvascular y la entrega a la carga por vía subcutánea C6 gliomas.

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Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Introducción a la técnica de ultrasonido enfocado destrucción de microburbujas

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Investigación

Bioingeniería

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Entrega y transfección de genes en células humanas de cáncer de páncreas con factor de crecimiento epidérmico receptor dirigidos a base de gelatina Nanovectors Ingeniería

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Monitoreo en tiempo real de Ultrasonido de alta intensidad (HIFU) Ablación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine hígados Uso Movimiento armónico Imaging para Ultrasonido Focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Fabricación fantasma de alcohol polivinílico específica del paciente con ultrasonido y contraste de rayos X para la planificación de la cirugía de tumor cerebral

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...