Este trabajo fue apoyado por la Coalición de Georgia Cancer donaciones R9028.

Razón fundamental Explotar el uso de Thermo Scientific Dharmacon oligos, del 50 al 80-mers, aquí se presenta un procedimiento, basado en un ensayo de la corrección de genes, por lo que oligos puede transferir la información genética en el ADN genómico de células de levadura, después de recocido para la meta de ADN cromosómico. El éxito de la orientación por oligos se califica por la aparición de colonias de levaduras que muestra el fenotipo esperado. Si la modificación genética deseada se realiza en una o más ribonucleótidos incorporado en la secuencia oligo, la información genética fluye directamente de las vías de ARN para la meta de ADN cromosómico, por lo tanto, una forma de ARN / ADN híbrido en el nivel de los cromosomas durante el proceso de selección. La ribonucleótido / s de un Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo puede servir como plantilla para la orientación de genes a través de la síntesis de reparación del ADN o se puede integrar en el ADN y servir como plantilla durante la replicación del ADN. En estos experimentos se utiliza la levadura / Saccharomyces cerevisiae / modelo de sistema eucariota, sin embargo, un enfoque similar puede aplicarse también en otros organismos o tipos de células. En este vídeo, se utiliza un Thermo Scientific Dharmacon oligo diseñado con homología a un lugar de destino genómico de levadura y contiene un ribonucleótido en el medio para corregir una mutación en el gen diana. Después de la transformación con el oligo contiene ARN, se observa la corrección de la página dirigida a una determinada frecuencia, lo que indica que las vías de ARN del oligo podrían ser incorporados en el ADN cromosómico y servir como molde para la síntesis de ADN durante la replicación del ADN. La información genética dentro de la zona de ARN es estable transmitido a las generaciones siguientes de células. A continuación se describen los pasos de la transformación de células de levadura por la Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo y el enfoque para detectar la información de la transferencia de ARN en el ADN cromosómico. A. Diseño de la Oligo que contiene ARN utilizado en este experimento Hemos diseñado un oligo que contienen ARN para corregir un defecto genético en la levadura S. cerevisiae ADN cromosómico en el locus trp5. La cepa de levadura utilizada en el protocolo contiene un gen mutante trp5 con una deleción de dos bases y una mutación sin sentido (Figura 1). Cepa de levadura como es un mutante auxotróficos triptófano y no forma colonias en los medios de comunicación sin triptófano. La secuencia de ADN del gen TRP5 está disponible en la Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). El Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo utilizado en este protocolo es un 65-mer con una inserción de ADN de dos-base, diseñado para corregir la mutación por deleción y un ribonucleótido diseñado para corregir la mutación sin sentido del alelo trp5 (Figura 1). La secuencia del oligo está diseñado de la siguiente manera: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo es sintetizada por Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) en la escala de 200 nm, y desalado es, desprotegido y utilizado sin purificación PÁGINA. B. Preparación del Oligo que contiene ARN para la Transformación de la levadura (modificado de Storici et al., 2007 1) <ol><li> Limpie los materiales que serán utilizados para el experimento, con tubos de oligo, pipetas, vórtice, bastidores, área experimental y guantes usados ​​por el investigador con la solución de descontaminación RNasa para eliminar la contaminación potencial de RNasa antes de que comience todo. Use agua libre de RNasa, reactivos químicos, tubos y pipetas de todos los pasos. Cada paso en este experimento debe ser libre de RNasa. </li><li> Resuspender el Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo recibido de la empresa a 250 pmoles / l de solución madre con agua libre de RNasa y agitar vigorosamente para disolver el precipitado. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Inmediatamente antes de la transformación, descongelar el oligo contienen ARN en el hielo y se diluye a 50 pmoles / ml con agua libre de RNasa en RNasa libre de los tubos. Cada transformación requiere un nmol de los oligos que contienen ARN. </li><li> Desnaturalizar una cantidad elegida de los oligos que contienen ARN en el bloque 100 ° C de calor durante 2 minutos para eliminar las estructuras secundarias de los oligos. </li><li> Inmediatamente después de la desnaturalización se coloca el tubo en hielo. Mantener en hielo hasta la transformación. </li><li> Como el control en el experimento de un ADN único correspondiente oligo se utiliza. Este oligo se descongela de -20 ° C y se preparó para la transformación de los oligo-ARN que contienen, como se describió anteriormente. </li></ol> C. La transformación de células de levadura con el Oligo que contiene ARN <ol><li> Inocular 5 ml de medio rico líquido YPD con la trp5 células de levadura mutante y crecer a 30 ° C durante la noche (ver Materiales). </li><li> La transferencia de 1,5 ml del cultivo de una noche en 50 ml de medio líquido YPD. </li><li> Se incuban las células en un agitador de 30 ° C (225 rpm) durante 4 horas. </li><li> Prepare la solución de uny Solución 2 inmediatamente antes de la transformación en RNasa libre de los tubos (ver Materiales). </li><li> Transferir el cultivo de células a un 50 ml RNasa libre de tubo y giran a 3000 rpm, lo que corresponde a 1.562 g, durante 2 minutos. El pellet de células de la precipitación es de aprox. 0.3 cm 3. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y lavar con 50 ml de agua libre de RNasa y giran a 3000 rpm durante 2 min. </li><li> Repita el paso 6 por 5 veces para deshacerse del medio de cultivo y RNasas que podrían estar presentes en el medio tanto como sea posible. </li><li> Retire el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de la solución 1 y giran a 3000 rpm durante 2 min. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 250 l de Solución 1. Esta cantidad de células es suficiente para 7-8 transformaciones. </li><li> Alícuota de 50 l de la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de RNasa libre, se añaden 20 l de ARN que contiene la solución oligo de trabajo (1 nmol), o 20 l de ADN oligo única solución de trabajo (1 nmol), o 20 l de agua estéril sin oligo para el control negativo. A continuación, añadir 300 l de solución de 2 por cada reacción de transformación. No hay necesidad de añadir ADN de esperma de salmón en el proceso de transformación, como la Ley de oligos como portador de sí mismos. </li><li> Agitar vigorosamente para mezclar componentes de forma homogénea. </li><li> Incubar las reacciones de transformación a 30 ° C durante 30 minutos en una coctelera. </li><li> De choque térmico a 42 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar las células a 5000 rpm, lo que corresponde a 2.236 g, durante 4 minutos. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 100 l de agua estéril. </li><li> Tomar una alícuota de esta suspensión celular y se diluye con agua estéril de 100.000 veces y células de la placa en una placa de YPD con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Placa de todas las células se resuspendieron en cada reacción de transformación de una placa de Petri de medio completo sintético sólido sin triptófano (SC-Trp) con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 4-5 días (Figura 2). </li></ol> D. Análisis de la corrección de genes por el ARN que contienen Oligo <ol><li> Cuente el número de colonias crecidas en el medio selectivo (Figura 2), así como en medio YPD para calcular la frecuencia de corrección de genes para la oligo contienen ARN, el ADN oligo-y sólo para el control de no-oligo. Compare el número obtenido. La tasa de reversión espontánea de la trp5 alelos con la supresión de dos bases y la mutación sin sentido es inferior a 9.10 en la cepa de levadura que se usa, por lo tanto no esperamos la formación de colonias en el medio selectivo cuando no oligos se añaden a las células. </li><li> Racha de varias colonias transformantes seleccionados al azar en medio YPD para obtener aislados de una sola colonia. Esperar dos días para el crecimiento de la colonia, luego tomar varias (al menos 5) colonias aisladas y hacer parches en YPD y en medio selectivo. </li><li> Diseño de un par de cebadores para amplificar la región (250-1,000 pb) dirigido por el oligo contienen ARN por PCR colonia (fig. 1B). El procedimiento para la colonia PCR es la siguiente (modificado de Storici y Resnick, 2006 2). <ol><li> Suspender las células (aproximadamente 1 mm3) tomadas de los parches individuales en 50 l de agua y añadir una unidad de liticasa. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de incubación en un bloque térmico a 100 º C durante 5 minutos para romper las células y el ADN genómico de la liberación en la solución. </li><li> Las condiciones de PCR: La reacción de PCR incluye 10 l de la solución de resuspensión celular, 50 pmoles de cada uno de adelante y atrás, 1 l de 10 mM dNTPs, 1 unidad de Taq polimerasa, 5 l de tampón 10x y se ajusta con agua estéril a una volumen final de 50 ul. El programa de PCR es de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s, a 55 ° C y 1 min a 72 ° C, un tiempo de extensión final de 7 min a 72 ° C, a continuación, las muestras se mantienen a 4 ° C. Una ampliación de tiempo de 1 min / kb se supone para esta reacción. </li><li> Tras la PCR, las muestras se ejecutan en un 1% o 2% (dependiendo del tamaño esperado del producto de PCR) en gel de agarosa para la observación del producto de PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Si la información genética transferida por el oligo contienen ARN genera un nuevo sitio de restricción en la región de la levadura objetivo genómica (fig. 1B), es posible verificar la correcta transferencia de información por parte de la digestión del producto de PCR con la enzima de restricción apropiada. Si no hay ningún sitio de restricción es generado por el oligo contiene ARN, vaya al paso 6. Digerir los productos PCR utilizando una enzima de restricción específica. La reacción de digestión con 6 l de producto de PCR, buffer, BSA (puede no ser necesario para algunas enzimas, consulte las instrucciones de la enzima que se utiliza), 0,5 l de enzima de restricción, y agua estéril a 15 microlitros. Las muestras se incuban durante 1 hora a la temperatura específica de la enzima utilizada. </li><li> Ejecutar una muestra no digerida, junto con las muestras digeridas en la misma fila de un 2% en gel de agarosa alobservar la modificación genética transferida por las vías de ARN del oligo que contienen ARN (Figura 3). </li><li> Purificar productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y prepararlos para la secuenciación del ADN. Enviar muestras para secuenciar con los mismos cebadores utilizados para amplificar el producto. </li><li> Analizar los resultados de la secuenciación del ADN mediante un software que permite la alineación de secuencias múltiples con una secuencia de referencia elegido (Figura 4). </li></ol> E. alcalinos Tratamiento de la oligo que contienen ARN (Figura 5) <ol><li> Para cada reacción, se añade 1 nmol (4 l de 250 pmoles / l de solución madre) de los oligo contienen ARN o ADN oligo-en un tubo de 1.5 ml. </li><li> Agregar 4 l de NaOH 1 M para la hidrólisis, o bien añadir 4 l H 2 O como control negativo, y se incuba a 65 ° C en un baño de agua durante 1 h. A continuación, pasar de un baño de agua a hielo. </li><li> Neutralizar con 2 l de 1,2 M de HCl, 4 l de 1 l M Tris-HCl, y 4 de H 2 O, o, alternativamente, 6 l de H 2 O y 4 l de 1 M Tris-HCl de control negativo. Mantener en hielo hasta la transformación. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama esquemático de la defectuosa trp5 gen y del alelo TRP5 corregido por el oligo contienen ARN. A) El gen mutante trp5 contiene una deleción de dos-base (triángulos en negro) y una base de mutación sin sentido (asterisco). La única cadena de ARN que contiene oligo con la inserción de dos-base (azul bucle) y 1-ARN sustitución de base (rectángulo rojo) que genera un sitio Van91 I enzima de restricción (mostrado por el soporte) se transforma en células de levadura para corregir los defectos genéticos del gen trp5. B) Después de que el gen TRP5 es reparado por el oligo que contienen ARN (bases corregido se indican como rectángulos azules), el sitio Van91 que se genera en el gen TRP5. Un fragmento de 278 pb incluyendo sólo una Van91 sitio de restricción que en TRP5 gen está amplificado por PCR con un par de primers (P1 y P2). El 177 pb y 101 pb fragmentos generados tras la digestión de la P1 y P2 de productos PCR por Van91 que también se muestran. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultado de la transformación con el oligo contienen ARN. A) Las células de levadura transformadas sin oligo no forman colonias en el medio SC-Trp, ver las placas AB. B) Las placas cg colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la oligo contienen ARN. C) Las placas hl colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la ADN-sólo oligo correspondiente control. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La detección de la transferencia de información genética del ARN que contiene oligo de ADN cromosómico de levadura por restricción de la digestión del producto de PCR amplifica la región genómica específica. 2% electroforesis en gel de agarosa de las muestras de PCR amplificado por P1 y P2 y se digiere con enzimas de restricción que Van91. Las calles 1, 8 y 15, escalera de ADN con tamaños de 100, 200, 300, 400 y 500 pb indica a la izquierda, calle 2, producto de PCR de trp5 lugar amplificado a partir del ADN genómico de la cepa mutante trp5, calle 3, PCR producto amplificado de ADN genómico derivados de una colonia Trp + dirigida por el oligo de ADN de sólo carril de 7.4, los productos de amplificación de PCR de ADN genómico derivados de Trp + colonias dirigidas por el oligo contiene ARN, calle 9 y 14 años, Van91 I restricción de la digestión de los productos PCR de los carriles de 2 a 7. La presencia de las bandas de los productos en bruto de PCR en los carriles de 10 a 14 se puede explicar por digestión parcial por Van91 I en el locus TRP5 (CCACATTCTGG). Teniendo en cuenta que el sitio de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) puede tener varias secuencias, el sitio genera en TRP5 no puede ser el objetivo más óptimo para la enzima. De hecho, el ADN después de la secuenciación de todo lo anterior, los productos de PCR se detecta ningún cambio adicional más allá de las realizadas por los oligos (ver Figura 4). Los 278 puntos básicos la banda de amplificación de PCR por P1 y P2 cebadores y las bandas de producto de digestión por Van91 I de 177 pb y 101 se muestran las flechas a la derecha. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Thumb" /></a> Figura 4. Resultados de la secuenciación de ADN que muestran la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. A electroferograma ADN) de la región genómica orientada por el oligo contienen ARN. El G en la secuencia de ADN (en azul en caja) se deriva de la RG en el oligo contienen ARN. También en caja es la inserción de las bases CG. Resultados de la secuenciación de todos los demás productos de la PCR son también como CLEar como éste, con señales fluorescentes muy por encima del fondo. B) Las secuencias de la región TRP5 del Trp + transformantes dirigido por el oligo de ADN sólo (T1) y el oligo que contienen ARN (T2-T5) coinciden en la secuencia de consenso en la parte superior y se comparan con el de la trp5 células mutantes antes de la orientación por los oligos (ADN genómico, de color rojo con fondo gris). La reparación de ARN que contiene oligo en la parte inferior tiene dos base de la inserción del ADN y una base (G) la sustitución de ARN marcados en rojo. Las regiones en caja de color azul con la demostración de que el tono amarillo que contienen ARN oligo, así como el oligo de ADN sólo se corrige con precisión la mutación y la eliminación de mutación sin sentido en todas las muestras analizadas. Las líneas de puntos marcan la posición de la secuencia de ARN que contiene oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Tratamiento alcalino impide la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. La frecuencia de transformación por el oligo que contienen ARN (R) se muestra en la barra roja y que por el oligo de ADN sólo (D) se muestra en las barras azules. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres transformaciones independientes para cada oligo. El ADN sólo se muestra la frecuencia oligo transformación similar con y sin tratamiento con NaOH. De otra manera, la frecuencia de transformación por el oligo contienen ARN cae a 0 tras el tratamiento con NaOH. Por lo tanto, la preparación con el oligo contienen ARN no está contaminado con ADN de sólo oligo, por lo tanto, la frecuencia de la transformación observada es específica para el oligo contienen ARN.

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

La producción de video para este artículo fue patrocinado por Thermo Fisher Scientific, que produce los reactivos e instrumentos utilizados en esta publicación.

El hecho de que el ARN puede transferir la información genética directamente al ADN genómico de las células fue descubierto explotar el uso de sintéticos que contienen ARN oligos (oligos Dharmacon sintetizado) 1. Era la prueba de principio de que las células pueden utilizar el ARN que contienen moléculas o secuencias de ARN-sólo como plantillas para la síntesis de ADN. El uso de ARN que contienen oligos no sólo condujo a la demostración de que la información genética se pueden transferir directamente a partir de ARN a ADN genómico sin la necesidad de una transcripción reversa de copias de ADN intermedios, sino también a la prueba de que el ARN puede ser utilizado como homóloga plantilla en la reparación de un daño en el ADN 1,3. Los oligos se puede hacer de ARN o de sólo contienen sólo un ribonucleótido único incrustado en una secuencia de ADN, como en el ejemplo que presentamos aquí. El oligo contienen ARN tiene un ribonucleótido código diseñado para corregir la mutación sin sentido en el genoma defectuoso trp5 alelo. La transferencia de información genética de la ribonucleótido en el ADN genómico se pone de manifiesto por un cambio en el fenotipo (células que crecen en el medio carecen de triptófano) de las células afectadas. La frecuencia de la corrección de genes obtenidos con el oligo que contienen ARN se mide y compara con la de un ADN de sólo el control oligo. Mediante la realización de este ensayo la corrección de genes en células diferentes orígenes, en la que mutan los genes de diferentes hongos, que puede detectar qué factor / s afectan específicamente a la orientación por los oligos que contienen ARN. Por lo tanto, puede revelar los mecanismos de cómo las células regulan la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos. Simplemente el diseño de las diferentes variantes de los oligos que contienen ARN se puede determinar la probabilidad de una determinada zona de ARN para servir como modelo en la modificación del ADN y podemos determinar la estabilidad de las secuencias específicas de ARN incrustado en el ADN. Por otra parte, podemos identificar cuáles son las preferidas en los sustratos in vivo de factores que interactúan con el RNA / híbridos de ADN. Mientras que varios estudios in vitro, sobre todo la utilización de ARN corto oligos que contienen, se han realizado para caracterizar la función de los factores que pueden reconocer el ARN en un híbrido con el ADN, como las enzimas RNasa H 4, en funciones in vivo de RNasas H, así como la identidad de otras proteínas que podrían afectar ADN / ARN estabilidad híbridos siguen siendo en su mayoría desconocidos. La posibilidad de utilizar que contiene ARN oligos de una longitud considerable (50 a 80-meros) y una calidad óptima (por ejemplo, Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos) ha abierto el camino para examinar una amplia gama de procesos moleculares in vivo directamente en el las células de interés. Como se muestra en este video, con la transformación que contienen ARN oligos requiere esencialmente a sólo unos pasos adicionales en comparación con la transformación con las moléculas de ADN, para evitar la degradación por ARNasas. Por lo tanto, la transformación utilizando ARN que contienen oligos no se limita al sistema de la levadura, pero se puede aplicar a cualquier organismo o tipo de célula donde la transformación de ADN oligos es competente. En conclusión, por atacar a las células que contienen ARN oligos ofrece la oportunidad de generar híbridos de ADN / ARN y ribonucleótidos incrustado en el ADN in vivo en las células. La estabilidad, la función y sus consecuencias en vivo genera ARN / ADN híbridos pueden ser analizadas y caracterizadas, lo que podría revelar mecanismos desconocidos de reparación del ADN y revelando nuevas estrategias para la manipulación genética.

A. Transformación de los reactivos y los medios de comunicación (modificado de Storici y Resnick, 2006 <ol><li> YPD (levadura peptona dextrosa): Para 1 litro, 10 g de extracto de levadura, 20 g de soja peptona, 20 g de dextrosa. Agregar 15 g de agar YPD para los medios sólidos. Autoclave antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Solución 1: 0,1 M de acetato de litio. Preparar inmediatamente antes de la transformación. Una solución es una solución de trabajo, por lo que se prepara directamente a partir del polvo. No hay solución de reserva se hace. Mantener a temperatura ambiente. LiAc aumenta la permeabilidad de la pared celular de la levadura en el ADN. </li><li> Solución 2: 0,1 M de acetato de litio y el 50% de polietilenglicol 4000. También la solución 2 es una solución de trabajo y se hace directamente desde el polvo. No existe una solución madre se prepara. Mantener a temperatura ambiente. Depósitos PEG oligos en células de levadura. </li><li> Que contienen ARN oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalado, se desprotegió y no purificada. Volver a suspender a 250 pmoles / l. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Sólo oligos de ADN, 50-80-mers, desalado y no purificada. Resuspender a 50 pmoles / l. Almacenar a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic medios completos carecen de triptófano) medio sólido. </li><li> 0,5 cm de diámetro perlas de vidrio, esterilizados en autoclave. </li><li> RNasa-off: la solución de RNasa de descontaminación. </li><li> DNasa / RNasa libre, tubos de centrífuga estéril. </li><li> DNasa / RNasa libre, tubos cónicos estériles. </li><li> DNasa / RNasa libre, estéril consejos aerosol con una pipeta ZAP: 100-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colonia PCR materiales. <ol><li> Cartilla de ADN, desalado y no purificada. Disolver en agua destilada a 50 pmoles / l. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Taq ADN polimerasa, buffer, dNTPs. </li><li> Tubos para PCR. </li></ol> C. de purificación de PCR. <ol><li> PCR kit de purificación. </li></ol> D. electroforesis en gel. <ol><li> Agarosa. </li><li> 1 x TBE funcionamiento (45 mM mM Tris-borato y un tetraacetato etilendiamina) diluido de TBE 10x. </li><li> Prestained marcador de peso molecular. </li><li> ADN colorante de carga. </li></ol> E. restricción de la digestión. <ol><li> Las enzimas de restricción, los tampones de 10x, la BSA. </li></ol> F. álcali tratamiento para la oligo contienen ARN. <ol><li> 1 M de NaOH. </li><li> 1,2 M de solución de HCl. </li><li> 1 M de Tris-HCl, pH 7,4, solución. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Polímeros sintéticos cortos de ácidos nucleicos, oligonucleótidos (oligos), son las herramientas más funcionales y generalizada de la biología molecular. Oligos se puede producir para contener ADN o ARN deseado secuencia y se puede preparar para incluir una amplia variedad de base y las modificaciones de azúcar. Por otra parte, oligos pueden ser diseñados para imitar las alteraciones específicas de ácidos nucleicos y por lo tanto, puede servir como una herramienta importante para investigar los efectos de daño en el ADN y los mecanismos de reparación. Hemos encontrado que Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos con una longitud de entre 50 y 80 nucleótidos pueden ser particularmente adecuado para estudiar, en vivo, funciones y consecuencias de ARN cromosómico / híbridos de ADN y de ribonucleótidos incrustado en el ADN. ADN / ARN de los híbridos puede formar fácilmente durante la replicación del ADN, la reparación y transcripción, sin embargo, se sabe muy poco sobre la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos en las células y en qué medida estos híbridos pueden afectar a la integridad genética de las células. Que contienen ARN oligos, por lo tanto, representan un vector ideal para introducir ribonucleótidos en el ADN cromosómico y generar ADN / ARN de los híbridos de longitud elegida y la composición de bases. Aquí se presenta el protocolo para la incorporación de ribonucleótidos en el genoma de la levadura modelo de sistema eucariota / Saccharomyces cerevisiae /. Sin embargo, nuestro laboratorio ha utilizado Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos para generar ADN / ARN de los híbridos a nivel cromosómico en los sistemas de células diferentes, desde las bacterias a las células humanas.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

generation-rnadna-hybrids-genomic-dna-transformation-using-rna

Research

JoVE Journal

Biology

26.7K vistas.  Georgia Institute of Technology. Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Video: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

Investigación

Biología

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

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La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genómica resonancia magnética - un recurso público para el estudio de patrones de secuencia en el ADN genómico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Transformación de Genómica de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...