Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Premio CARRERA (0953583) y el Instituto Nacional de Salud NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

En este protocolo, un oligonucleótido (RBMB1) fue marcado en su extremo 5 &#39;con un colorante indicador CF640R y tiene la secuencia: 5&#39;mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC Mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3&#39;. Dominios autónomos complementaria, que impulsan la formación de la estructura de horquilla, están en negrita. El segundo oligonucleótido (RBMB2) se marcó en el extremo 3 &#39;con un extintor Iowa Negro RQ-Sp y tiene la secuencia: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. 1 Preparación de RBMBs <ol><li> Realizar un giro rápido de los tubos que contienen los oligonucleótidos RBMB1 y RBMB2, para asegurar el oligonucleótido seca es en la parte inferior del tubo, y resuspender en DNasa y RNasa libre de agua a una concentración final de 100 mM. Por ejemplo, una muestra de 10 nmol de oligonucleótido debe resuspendió en 100 l de agua. </li><li> Measure la concentración exacta de muestras RBMB1 y RBMB2 acciones mediante espectroscopia UV-vis. <ol><li> Mezclar 3 l de la muestra con 117 rbmb mu l DPBS (sin calcio y magnesio) en un tubo de microcentrífuga. </li><li> En blanco el espectrofotómetro con DPBS y medir la absorbancia 200-800 nm. Nota: Pico de las absorbancias a 260 nm y 650 nm debe ser visible. </li><li> Calcular la concentración de stock de las muestras rbmb basados ​​en la absorbancia a 260 nm (o 650 nm para RBMB1), usando la ecuación: Stock Concentración (M) = A 260 factor de dilución * / coeficiente de extinción donde A 260 es la absorbancia a 260 nm y el factor de dilución es 40. Nota: El coeficiente de extinción para la rbmb se puede encontrar en la hoja de especificaciones proporcionado por el fabricante oligonucleótido. El coeficiente de extinción de CF640R a 650 nm es 103.000. </li></ol></li><li> Mezclar 20 l de 100 RBMB1 M, 30 l de RBMB2 100 m, 6 l 10x; Tampón fosfato (10x tampón fosfato 480 mM K 2 HPO 4, 45 mM KH 2 PO 4, 140 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) y 4 l de DNasa y RNasa libre de agua. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. Nota: Esta es normalmente suficiente para aproximadamente 50 estudios. </li><li> Preparar una columna de cromatografía líquida utilizando 75 prep grado Superdex de quitar cualquier oligonucleótidos RBMB2 sin hibridar. Utilice un niño de 8 ml (0,7 x 20 cm) de la columna de cromatografía de líquidos con un volumen de ~ 4 ml cama para purificar el pequeño volumen de sondas mixtas. </li><li> Lavar y equilibrar la Superdex con ~ 50 ml de tampón de fosfato 1x utilizando una bomba de jeringa se ejecuta en un flujo a una velocidad de flujo de 0,6 ml / min. Antes de que todo el fluido entra en el volumen de lecho, detener la bomba de jeringa, separarla, y dejar que el líquido restante pasa por la columna por gravedad. </li><li> Cargar la mezcla rbmb (60 l) en la columna de cromatografía. <ol><li> Después de la muestra rbmb tiene completamenteentrado en la cama, añadir lentamente otros 250 l de tampón de fosfato 1x a la parte superior de la cama para asegurarse de que toda la muestra ha entrado completamente la columna. </li><li> Llene la columna a la llanta con tampón de fosfato 1x. Cierre la tapa y encienda la bomba de jeringa - la jeringa debe estar lleno de ~ 50 ml 1x PBS y se ejecute a una velocidad de flujo de 0,6 ml / min. </li><li> Una vez que el rbmb se acerca a la parte inferior de la columna - la muestra rbmb típicamente puede ser visualizado fácilmente debido a que el color del colorante incorporado en la sonda - recoger el flujo a través a 2 gotas por tubo de microcentrífuga (1,5 ml). Deje de tomar la muestra una vez que el color dentro de los tubos de microcentrífuga se aclara. </li></ol></li><li> Combine los tubos que contienen la muestra rbmb color - típicamente 5-6 tubos - y cargarlo en un dispositivo de filtro centrífugo (10.000 MW de corte). Centrifugar la muestra a 10.000 RCF durante 20 min o hasta que el volumen deseado. Nota: Estas velocidades y tiempos típicamenteproducir un volumen final de ~ 30 l. </li><li> Medir la concentración exacta de la muestra rbmb purificada mediante espectroscopia UV-Vis. <ol><li> Tomar 3 l de la muestra rbmb concentrada y mezclar con 117 mu l DPBS en un tubo de microcentrífuga. </li><li> En blanco el espectrofotómetro con DPBS y medir la absorbancia 200-800 nm. Nota: Pico de las absorbancias a 260 nm y 650 nm debe ser visible. </li><li> Calcular la concentración de stock de la rbmb hibridado basado en la absorbancia a 650 nm, usando la ecuación: Stock Concentración (M) = A 650 factor de dilución * / coeficiente extinto donde A 650 es la absorbancia a 650 nm, el factor de dilución es 40. Nota: El coeficiente de extinción para CF640R a 650 nm es de 103.000 y el coeficiente de extinción de Iowa Negro RQ es ~ 20000. Los coeficientes de extinción son aditivos y no son sensibles a la hibridación. Por lo tanto, la muestra de stock rbmb tiene un coeficiente de extinción combinada de approximately 123 000 a 650 nm. </li></ol></li><li> Etiquetar el tubo de manera apropiada con el nombre y la concentración y se almacenan a -20 ° C para su uso futuro. </li></ol> 2 Preparación de poli-D-lisina recubierto de 8 pocillos Septadas cubreobjetos <ol><li> Preparar una solución de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina por disolución de 5 mg de poli-D-lisina (polvo liofilizado, irradiado-g) en 25 ml de agua esterilizada en un ambiente estéril. </li><li> Añadir 200 l de la solución de poli-D-lisina 0,2 mg / ml a cada pocillo de un cubreobjetos de 8 pocillos cámaras, en un ambiente estéril. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 16-18 horas en la campana de cultivo de células. </li><li> Aspirar el poli-D-lisina y lavar el pozo 3 veces con agua destilada estéril. Nota: Los portaobjetos de cámara recubiertas pueden almacenarse a 4 ° C. </li></ol> 3. Sonda Entrega Nota: El sistema celular utilizada debe contener un constructo de gen integrado que expresa RNA con al menos 4-secuencial binding sitios para la rbmb en la región 3 &#39;no traducida (UTR). Las secuencias diana deben ser complementarias al bucle del rbmb. Se aconseja que como control negativo, la misma línea de células por ingeniería genética para expresar la misma construcción génica, pero sin las repeticiones en tándem. En este protocolo, una línea celular de fibrosarcoma humano HT1080, fue diseñado para expresar ARN GFP con repeticiones de 96 en tándem de la secuencia diana rbmb en la 3&#39;-UTR. La línea celular de control fue diseñado para expresar GFP de tipo salvaje ARN. <ol><li> Células de la placa en un matraz T25 en 40-50% de confluencia un día antes de la entrega de la sonda. Cultivar las células con medio DMEM suplementado con 1% penicilina / estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS), y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Al día siguiente, encender la microporator y configurar los parámetros de microporos a 950 V, 2 pulsos, 25 ms. Nota: Estos parámetros se han optimizado para las células HT1080, pero son de tipo celular dependiente y pueden ser adjusTed para otros tipos de células como se describe en las instrucciones del fabricante. </li><li> Llene el tubo de microporos con 4 ml de tampón electrolítico y colocarlo en la estación de microporos. </li><li> Sacar la muestra de stock de rbmb purificado y descongelarlo. Diluir varios microlitros a una concentración final de 12 mM con tampón de fosfato 1x. Se necesita 1 l para cada microporos. </li><li> Pipetear 1 ml de medio de cultivo con FBS pero sin antibióticos en un tubo de microcentrífuga. Nota: Esto será utilizado para suspender las células inmediatamente después de microporos y se puede dejar de lado, cerca del dispositivo de microporos, por el momento. La inclusión de antibióticos en medios de cultivo disminuirá la viabilidad celular después de microporos. </li><li> Retire el medio de cultivo celular de las células HT1080 de ingeniería (60-80% confluentes), lavar las células con 1 ml de Ca2 + y Mg2 + DPBS -Libre una vez, y se incuba con 1 ml de tripsina durante 1-2 min. </li><li> Detenga el trypsinization mediante la adición de 1 ml de medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, antibióticos y sin rojo de fenol, y la transferencia de las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar las células en el tubo de microcentrífuga a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, resuspender y combinar los sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de DPBS. </li><li> Tomar 10 l de la suspensión celular bien mezclado y contar las células. </li><li> Pipetear las células arriba y abajo varias veces para asegurarse de que están bien dispersos y transferir 300.000 células con DPBS en un nuevo tubo de 1.5 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. Resuspender el precipitado en tampón de resuspensión 11 l y la pipeta arriba y abajo varias veces para asegurar que las células se dispersan bien. Asegúrese de no generar burbujas de aire. Nota: Las burbujas de aire causarán una chispa durante microporación y dar lugar a la entrega rbmb pobres y la muerte celular. </li><li> Añadir 1 l de la rbmb diluido (12 M) y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Una vez más tener cuidado de no generar burbujas de aire. </li><li> Aspirar 10 l de la mezcla de células rbmb con la pipeta de microporos, e inserte la pipeta en el tubo de microporos. Presione el botón de inicio para iniciar el microporación. Nota: No debe haber burbujas de aire visibles en la punta. </li><li> Cuando la pantalla del microporator muestra la terminación, retirar la pipeta de la estación, expulsar la mezcla de 10 l en el tubo de microcentrífuga que se preparó anteriormente, con medio de cultivo con 1 ml de FBS, pero sin antibióticos. Mezclar suavemente oscilando el tubo de lado a lado varias veces. </li><li> Haga girar las células a 200 xg durante 5 minutos y se lavan las células dos veces más, en 1 ml de fenol medio de cultivo libre de rojo con FBS pero sin antibióticos, para eliminar cualquier RBMBs que no fueron entregados a las células. Resuspender con 400 l de fenol medio de cultivo libre de rojo con FBS pero sinantibióticos. </li><li> Placa de las células microporos en el cubreobjetos recubiertos de 8 pocillos cámaras en 200 l por pocillo o en la confluencia deseada poli-D-lisina. </li><li> Opcional: Si es deseable a la imagen del núcleo, añadir Hoescht 33.342 a las células a una concentración final de 0,01 mg / ml. </li><li> Coloca los cubreobjetos con cámaras en una incubadora de cultivo celular. Se incuban las células durante 1-2 horas antes de la imagen, de modo que las células tengan suficiente tiempo para asentarse en la superficie cubreobjetos. Nota: Imaging puede realizarse tan pronto como 30 minutos después de la formación de microporos. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Encienda el sistema de incubación de la etapa superior de células vivas y equilibrar hasta que llegue a 37 ° C, 5% de CO 2, y 75% de humedad. </li><li> Encienda la fuente de luz del microscopio y fluorescente y abrir el software Metamorph. Nota: Otros paquetes de software similares para el control de microscopio y de adquisición de imágenes también se pueden utilizar. </li><li> Aplique aceite Immersol a laobjetivo. </li><li> Transferir el cubreobjetos cámaras con células microporos al sistema de incubación superior etapa de células vivas. Incubar el sistema de etapa superior hasta que la temperatura y los niveles de CO2 se estabilicen. </li><li> Abra la ficha Adquirir, en el software Metamorph. Haga clic en el botón Show en vivo para encontrar el campo, ajustar el foco con luz blanca y haga clic en el botón Detener en vivo. </li><li> En la ficha Adquirir, hacer clic y abrir el botón emergente de adquisición corriente, y establecer los parámetros de adquisición de películas deseadas. Adquirir 150 fotogramas utilizando el filtro de Cy5 / CF640R y guardar las imágenes en el disco duro. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke y el Dr. Ling Huang son empleados de IDT que ofrece oligonucleótidos en venta similares a algunos de los compuestos descritos en el manuscrito. IDT es, sin embargo, no es una empresa que cotiza en bolsa y que personalmente no posee acciones / capital en IDT.

La capacidad de las transcripciones de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas usando un microscopio de campo amplio convencional requiere una señal fluorescente brillante y fotoestable de estar asociado con cada una transcripción de ARN y un fondo fluorescente bajo que emana de sondas fluorescentes no unidos. En este método, una señal fluorescente brillante se logra mediante la hibridación de múltiples (hasta 96) sondas fluorescentes basados ​​en oligonucleótidos, es decir, RBMB...

La expresión y la regulación de las transcripciones de ARN es un proceso complejo y dinámico que es en gran parte responsable de controlar el comportamiento de las células y el destino. Aunque la importancia de ARN en función de la célula dictando ha sido conocido durante algún tiempo, a menudo es difícil establecer conexiones claras entre los dos ya que la mayoría de las herramientas de análisis de ARN carecen de la resolución espacial y temporal requerida para capturar eventos regulatorios importantes, tales como rotura de la transcripción, ARN el tráfico y el procesamiento del ARN localizada. Esto ha llevado a la llegada de varias técnicas que permiten transcritos de ARN individuales para ser visualizados en las células vivas en tiempo real 1. Quizás, la más prominente de estas técnicas utiliza una proteína de fusión GFP-MS2 al ARN diana que ha sido diseñado para contener repeticiones en tándem del sitio de unión MS2 en la 3&#39;-UTR 2,3. Al reunir múltiples moléculas GFP en estrecha proximidad, transcripciones de ARN individuales aparecen como puntos fluorescentes brillantesa través de microscopía de fluorescencia. El sistema de GFP-MS2 ha proporcionado una visión sin precedentes sobre el comportamiento de ARN, incluyendo la visualización directa y la medición de la transcripción de ruptura de 4,5, la detección de la única localización y procesamiento 6-9 subcelular, y de imágenes en tiempo real del transporte de ARN 10. Sin embargo, a pesar del enorme potencial del sistema de GFP-MS2, proteínas de fusión GFP-MS2 no unidos pueden crear una señal fluorescente de alta de fondo que limita la flexibilidad y el rango dinámico de esta técnica. Se han desarrollado varios enfoques para limitar esta señal de fondo, incluyendo la compartimentación subcelular de GFP no unido MS2-10, proteína de fragmento de complementación 11, y las proteínas de unión de ARN alternativos y objetivos 12. Sin embargo, todos estos enfoques siguen siendo sensibles a la expresión relativa y total de la diana de ARN y la proteína de fusión GFP-MS2. Como unaLTERNATIVA a los sistemas de GFP-MS2, balizas moleculares se han utilizado también para detectar transcritos de ARN de ingeniería con repeticiones en tándem del sitio de unión complementario en la 3&#39;-UTR 13,14. Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótidos de formación de horquilla que están etiquetados en un extremo con un extintor y en el otro extremo con un indicador fluorescente. Cuando no unido a ARN diana el reportero fluorescente y desactivador permanecer en estrecha proximidad, dando como resultado un estado de baja fluorescente. Tras la hibridación, el indicador fluorescente y el extintor se ven forzadas a separarse y la fluorescencia se restaura. Similar al sistema de GFP-MS2, la unión de múltiples balizas moleculares en un único transcrito de ARN resultados en una mancha fluorescente brillante que se puede identificar mediante microscopía de fluorescencia; Sin embargo, se espera que la fluorescencia de fondo a ser mucho menor, debido a la configuración de no unidos se inactivó balizas moleculares. Desafortunadamente, a pesar del mecanismo de activación inteligente que se incorpora en el mdiseño de baliza olecular, ahora hay evidencia creciente de que las balizas moleculares no hibridadas no permanecen en la conformación de horquilla cuando se introduce en las células vivas. En consecuencia, se generan una señal de falso positivo que reduce significativamente la relación señal a fondo. Para superar este inconveniente, recientemente hemos desarrollado una nueva sonda sintética de ARN de imágenes en las células vivas, ratiometric balizas bimolecular (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs se componen de dos cadenas de oligonucleótidos 2&#39;-O-metilo que forman una estructura híbrida con características tanto de ARN de horquilla corta (ARNhc) y balizas moleculares. El mecanismo de bucle y la activación de fluorescencia es similar a la baliza molecular, mientras que el largo dominio de doble cadena con un saliente 3 &#39;UU es más característico de shRNA. Las características shRNA están diseñados para impulsar las exportaciones nucleares, lo que hemos encontrado incrementos vida intracelular a&gt; 24 h, con la degradación observable mínimo, yimpide la apertura no específica del bucle. Como resultado RBMBs exhiben un fondo señal-significativamente mayor que las balizas moleculares. Cabe señalar que RBMBs no se puede preparar utilizando oligonucleótidos de ADN, ya que las sondas basadas en el ADN no poseen las mismas capacidades de exportación nuclear como sondas basados ​​en ARN. Estructuralmente, el bucle rbmb está típicamente diseñado para ser entre 15 y 21 bases de longitud, para crear un equilibrio entre la especificidad y la selectividad al ARN hibridación. El tallo corto que se forma a partir de los dos dominios de auto-complementarias está generalmente diseñado para ser 4 bases. Si se selecciona un vástago más largo, la velocidad de hibridación entre el bucle rbmb y ARN diana se ralentiza significativamente 17,18. Por el contrario, cuando se selecciona una secuencia de tallo más corto la temperatura de fusión es a menudo demasiado bajo para sostener la estructura de tallo-bucle a 37 ° C, dando lugar a una señal de fondo. La especificidad de la rbmb también es de color rojouced como la longitud del tallo se acorta. Dado que la secuencia de la rbmb tallo-bucle también puede influir en el rendimiento rbmb, debe ser cuidadosamente seleccionado 19. En particular, las secuencias de bucle ideales deben tener un mínimo de estructura secundaria, se hibridan con las secuencias de ARN con estructura secundaria mínimo, evitar los sitios de unión a proteínas, y evitar fuera de objetivo vinculante. Las predicciones de tanto rbmb y la estructura secundaria del ARN se pueden obtener usando software tal como mfold 20. Complementarias sitios fuera de objetivo pueden identificarse utilizando un nucleótido Basic Local herramienta para asignación de Búsqueda (BLAST). Sin embargo, debido a las inconsistencias en las predicciones del modelo y la dificultad en la identificación de los sitios de proteínas de presagiar, la especificidad de todos RBMBs última instancia, debe ser validada experimentalmente. Si se desea, un colorante de referencia unquenched que es insensible al estado de hibridación puede ser añadido a la rbmb 15. La adición de un colorante de referencia puede prOvide un marcador para la entrega de la sonda y se utiliza para la imagen radiométrica, si se requieren mediciones más precisas de la fluorescencia celular total. Los tintes de referencia permite realizar mediciones ajustadas a los diferentes antecedentes, debido a las variaciones de célula a célula en la entrega. Sin embargo, cuando la formación de imágenes individuales de ARN transcripciones del colorante de referencia no es necesario. En particular, algunos de los colorantes de referencia pueden interferir con la exportación de RBMBs desde el núcleo, dando lugar a una señal de fondo ligeramente más alto en el núcleo. Cuando se diseñan adecuadamente, RBMBs se pueden utilizar para imagen transcritos de ARN individuo en células vivas, si el ARN diana está diseñado para contener al menos cuatro sitios de unión rbmb (Figura 1B) 16. RBMBs pueden ser entregados de manera eficiente en una amplia gama de tipos de células a través de microporos, con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular 21, y las mediciones cuantitativas de la expresión génica puedeadquirida en los 30 minutos. Por otra parte, la metodología es bastante insensible a niveles de concentración rbmb y ARN diana, ya que la fluorescencia de RBMBs no unidos se apaga de manera eficiente. Aquí le ofrecemos una descripción detallada de la metodología utilizada para preparar y purificar RBMBs, así como un procedimiento general para la entrega de RBMBs en células vivas a través de microporos y la imagen de las transcripciones de ARN individuales en tiempo real.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="977">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease-free Water</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">AM9932</td>
			<td style="width:244px;">no DEPC-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DPBS</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No Ca2+ and Mg2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:207px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P290-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">P284-500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">S381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;">22364111</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Chromatography Column</td>
			<td style="width:207px;">Kimble Chase Life Science</td>
			<td style="width:220px;">420400-0720</td>
			<td>0.7x20cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Superdex 75 Prep Grade</td>
			<td style="width:207px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:220px;">17-1044-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:207px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:220px;">BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Syringe</td>
			<td style="width:207px;">BD</td>
			<td style="width:220px;">301035</td>
			<td>60mL, Luer-lok tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:220px;">UFC501096</td>
			<td>Mw 10,000 cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge 5418</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">P7280-5MG</td>
			<td>lyophilized powder, g-irradiated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">8-well chambered coverglass</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">155409</td>
			<td>Working volume 0.2-0.5mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HT1080</td>
			<td style="width:207px;">ATCC</td>
			<td style="width:220px;">CCL-121</td>
			<td>Human Fibrosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cell Culture Flask</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">430639</td>
			<td>25cm2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">11965084</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM without Phenol Red</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">21063029</td>
			<td>High glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:220px;">F2442-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penecillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Trypsin</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">25300054</td>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Neon transfection system</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon transfection system kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">02-671-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoescht 33342</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:220px;">H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IX-81 Inverted fluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Olympus</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">SOLA light engine</td>
			<td style="width:207px;">Lumencor</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metamorph</td>
			<td style="width:207px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td>Software controlling microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersol oil 518F</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:220px;">12-624-66B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

La creciente conciencia de que tanto la regulación temporal y espacial de la expresión génica puede tener consecuencias importantes sobre la función celular ha llevado al desarrollo de diversas técnicas para visualizar las transcripciones de ARN individuales en células vivas individuales. Una técnica prometedora que ha sido recientemente descrito utiliza una sonda de oligonucleótidos basados ​​en óptica, radiométrica faro bimolecular (rbmb), para detectar transcritos de ARN que fueron diseñados para contener al menos cuatro repeticiones en tándem de la secuencia diana rbmb en la región 3 &#39;no traducida. RBMBs están específicamente diseñados para emitir una señal fluorescente brillante tras la hibridación con ARN complementario, pero por lo demás permanecen apagados. El uso de una sonda sintética en este enfoque permite fotoestable, desplazada al rojo, y colorantes orgánicos altamente emisivo para ser utilizado para la imagen. La unión de múltiples RBMBs a las transcripciones de ARN de ingeniería resultados en puntos discretos de fluorescencia cuando se observa bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. En consecuencia, el movimiento de transcritos de ARN individuales puede ser visualizado fácilmente en tiempo real mediante la adopción de una serie temporal de imágenes fluorescentes. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega en las células mediante formación de microporos y vivimos de células de formación de imágenes de transcritos de ARN individuales.

Poco después de la formación de microporos de las células HT1080 en presencia de RBMBs, transcripciones de ARN individuales que fueron diseñados para contener múltiples sitios de unión rbmb en su 3&#39;-UTR aparecen como puntos fluorescentes brillantes cuando reflejada por el amplio campo de la microscopía de fluorescencia (Figura 2). Mientras que las transcripciones de ARN individuales con sitios de unión tan sólo cuatro rbmb se pueden obtener imágenes en las células vivas, más sitios en la...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vistas.  University of Pennsylvania.  Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real. 

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Investigación

Biología

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoreo en tiempo real de la activación de aurora quinasa A utilizando biosensores FRET conformacionales en células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...