Este trabajo fue apoyado por fondos de la semilla de la Universidad de Pittsburgh y los NIH AG028977 a ALF

Información general Tradicionalmente los gusanos transgénicos fueron generados por la microinyección de ADN transgénico en el C. elegans germinal 1,2,3,4. Mientras el éxito, este enfoque requiere de equipo especializado y el desarrollo de la experiencia con la anatomía del gusano y la técnica de microinyección. Más recientemente, el bombardeo biolística ha sido desarrollado como un enfoque alternativo que utiliza el ADN partículas recubiertas de oro para introducir ADN extraño en la línea germinal 5,6. Este enfoque requiere menos inversión de tiempo en términos de práctica para tener éxito. El bombardeo de biolística C. elegans para generar gusanos transgénicos tiene una eficiencia baja en el nivel de la lombriz individual para el éxito requiere una gran cantidad de animales. Estos se pueden cultivar en varias formas, pero nosotros usamos placas de huevo para reducir el trabajo y el número de placas en cuestión. Nuestro protocolo se inicia con la preparación de los platos de huevos y gusanos, y se centra en el protocolo mediante el bombardeo de Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Hemos adaptado nuestro protocolo, en parte, del trabajo de Berezikov et al 7. Con el bombardeo, el gen unc-119 se usa generalmente como un indicador de animales transgénicos. Cepas del gusano lleva esta mutación están muy coordinados y se mueven a duras penas, se regordete de aspecto, y son incapaces de formar larvas Dauer 8. El Dauer es una etapa larval alternativo que se utiliza para retrasar el desarrollo de un adulto reproductivo en condiciones adversas, y la entrada en Dauer está regulado por múltiples genes 9. Varias cepas portadoras del gen unc-119 están disponibles en el C. elegans Centro de Genética (CGC, Minneapolis, MN). El original DP38 cepa (UNC-119 (ED3)) también tiene una formación relacionada Dauer-constitutiva (daf-c) una mutación que pudiera afectar los experimentos posteriores. Varios laboratorios han outcrossed esta mutación, y la cepa HT1593 está disponible en la CGC. Nos encontramos con que los animales transgénicos son más fáciles de identificar con la cepa DP38 y tienden a usar esta cepa para la creación de animales transgénicos. Cuando es necesario, se HT1593 a la polinización cruzada de los gusanos transgénicos para eliminar la mutación daf-c. Obtener el DP38 gusanos para crecer es uno de los más lentos pasos del protocolo por lo que mantener un stock de placas de crecimiento, mientras que la preparación de los transgenes. Expresión del marcador de UNC-119 junto con el gen de interés permite una fácil identificación de los animales que expresan el transgén basado en el rescate de la motilidad normal y el tamaño del cuerpo 5. La UNC-119 genes se pueden obtener de varias fuentes y vectores utilizando el ADN genómico unc-119, unc-119 y promotor de cDNA y el ADN genómico de los más pequeños C. briggsiae gen se utilizan 8,10. Recientemente hemos descrito un protocolo simple de añadir un cassette de UNC-119 a cualquier plásmido que contiene un gen de resistencia a la ampicilina por recombinación homóloga 11 y un método para modificar fosmids gusano para transportar el gen unc-119 por Cre-lox de recombinación para generar animales transgénicos 12. Los plásmidos están disponibles en Addgene Inc. (Cambridge, MA). Mientras que el esfuerzo en la realización de un bombardeo solo es significativa pero manejable, el trabajo adicional que supone realizar bombardeos múltiples en un solo día es mínima. En consecuencia, de manera rutinaria cluster de la producción de gusanos transgénicos para reducir el trabajo necesario para la generación de cada uno. 1. Huevo Preparación Plate Los gusanos unc-119 mutantes son difíciles de cultivar en placas NGM estándar, ya que con sus problemas de movilidad tienden a morir de hambre en las partes de una placa, mientras que otras partes de la placa todavía contienen los alimentos. Platos de huevo resolver este problema ya que la capa gruesa de alimentos en los platos de huevos permite unc-119 lombrices para rastrear más fácilmente y para hacerse cargo de toda la plata 7. Las placas de huevo también tiene la ventaja de apoyar el crecimiento de un gran número de gusanos que menos se necesitan 13 planchas. Por lo general, cinco platos de huevo son suficientes para criar gusanos de un bombardeo. La receta a continuación hace unos 50 platos, pero pueden reducirse a la mitad para hacer menos, si lo desea. Las placas de huevo puede llegar a ser fácilmente contaminados por lo que usamos los antibióticos y antifúngicos en las placas y sólo utilizar los huevos generados por el tratamiento de hipoclorito para la siembra de las placas. Día 1: <ol><li> Prepare LB (400 ml) en una botella de 500 ml. Autoclave de 20 minutos. </li><li> Vierta ~ 50 10 cm placas de redes de próxima generación con un litro redes de próxima generación con 2% de agar. Añadimos nistatina 10 ml por litro y la estreptomicina a 200 mg / ml 13. </li><li> Cultivar una cultura de 40 ml durante la noche del OP50-1 en LB con 200 mg / ml de estreptomicina. Esta variedad es resistente a la estreptomicina y la disposición de CGC. </li><li> Autoclave de una botella de 500 ml paraal día siguiente. </li></ol> Día 2: <ol><li> Yemas por separado de 10 huevos de gallina en el frasco estéril. Nosotros utilizamos un separador de yema de huevo (disponible en tiendas para el hogar, incluyendo a Target). Shake. </li><li> Alcanzar un volumen de 400 ml con LB. Movimiento </li><li> Se incuba a 60 ° C durante 1 hora. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 40 ml de OP50-1. Movimiento </li><li> Distribuir 5.8 mL de la mezcla por placa. </li><li> Permita que las placas para ubicarse en la temperatura ambiente durante la noche. </li></ol> Día 3: <ol><li> Suavemente vierta el líquido residual de las placas. Deje que se seque con tapas de noche a temperatura ambiente. </li></ol> Día 4: <ol><li> Ponga las placas en una caja o bolsa de plástico y se almacenan a 4 ° C hasta que se necesite. Estas placas parecen estar bien usar durante 1-2 meses. </li></ol> 2. La siembra de las placas de huevo <ol><li> Ampliar el DP38 gusanos de 6 cm placas de redes de próxima generación mediante la adición de concentrados OP50 a las placas recientemente muerto de hambre. Para un solo bombardeo, usamos ~ 6 platos pequeños para las placas de semillas de huevo 5. De bombardeos múltiples, usamos las planchas menores de dos placas en lugar de semillas enriquecidas peptona antes de la siembra de las placas de huevo. </li><li> Aislar a los huevos de los gusanos a través del DP38 el uso de hipoclorito de 13,14. Resuspender los huevos estériles en buffers S-basal o M9 13,14. </li><li> Añadir los huevos (&gt; 10.000 por placa) con el número adecuado de placas de huevo. Crecen los gusanos en los platos de huevos a 20 ° C durante 7-10 días de uso para el bombardeo. Las placas estarán listas para usar una vez que los gusanos han comenzado a limpiar la comida de los platos. Estas placas son muy difíciles de matar de hambre y cada vez durante más tiempo que mejora el rendimiento del gusano. </li></ol> Bombardeo Preparamos las existencias de oro antes de tiempo y mantenerla almacenada a 4 ° C para su uso. También se necesitan no están manchados y moteados 10 cm placas de redes de próxima generación. Las placas deben ser sin mancha derramada con suficiente antelación y se deja secar por completo para facilitar la absorción del líquido añadido con los gusanos. En el día de los bombardeos, que lavar los gusanos primero y luego comenzar a preparar el ADN de las partículas recubiertas de oro. A continuación, añadir a los gusanos a la mancha placas de redes de próxima generación y terminar de lavar las partículas de oro y su transferencia a la macrocarriers. Preparación de partículas de oro: <ol><li> Pesar 60 mg de partículas de oro en un tubo de 1.7mL y de inmersión en etanol al 70% durante 15 min. Girar brevemente para precipitar las partículas de oro. </li><li> Lavar 3 veces en agua estéril y girar durante unos instantes para recoger el oro. </li><li> Resuspender el oro en 1 ml de 50% de glicerol estéril. Este es el oro de la solución madre de partículas y pueden ser almacenados durante meses a 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Flotar el DP38 gusanos de las placas de huevo con tampón S-basal o M9 y transferirlos a un tubo de 50 ml cónicos. </li><li> Mantener los tubos en el banco hasta que los gusanos se encuentran en la parte inferior. Y aspirar el buffer y añadir nuevos S-basal o M9. Lavar 2 o 3 veces, hasta memoria es relativamente libre de residuos. Mantenga a los gusanos en este paso hasta que el recubrimiento del ADN se ha completado. </li><li> Aspirar y dejar unos 2-3 ml de gusanos en el buffer por los bombardeos. Pasar a un plato de 10 cm sin mancha redes de próxima generación en el hielo. Es importante reducir al mínimo el volumen transferido en la placa de redes de próxima generación tendrá que secar por completo antes del bombardeo. Asegúrese de cubrir toda la superficie de la placa con los gusanos. </li><li> Permitir que se seque la placa sobre el hielo. El hielo se evitará que los gusanos se acumulen durante el secado. </li></ol> Este paso es importante: la placa debe estar seca y los gusanos distribuidas uniformemente en la placa de NGA. Mantener a los gusanos en el hielo les impide moverse en el plato y agregar en pilas. Preparación del ADN (para un bombardeo): <ol><li> Mezclar en un tubo de 1.7mL: <ul><li> 50μl partículas de oro. Resuspender bien antes de añadir. </li><li> 50μl de ADN (10-15ug). Vemos una pequeña diferencia entre el ADN circular o lineal. Por lo general se utiliza cartuchos de Qiagen Midiprep de purificación de ADN (Qiagen Inc, Valencia, CA). </li><li> 50μl 2,5 M de CaCl 2. Esta solución es estable durante varias semanas a temperatura ambiente. </li><li> 20μl 0,1 M espermidina. La espermidina es inestable en solución acuosa. Hacemos alícuotas de 70μl espermidina y almacenar a -20 ° C. A continuación, añadir 1 ml de agua justo antes de su uso para obtener una solución 0,1 M. Esta solución debe prepararse para cada bombardeo. Por lo general, el vórtice partículas de oro en un tubo de 1.7mL a una velocidad baja y agregue el CaCl2, ADN y espermidina / gota a gota, mientras que la protamina agitación. Para las personas que han transfectadas con fosfato de calcio esta técnica es familiar. También hemos utilizado protamina en lugar de la espermidina con muy buenos resultados 15. Se prepara una solución fresca (1mg/ml) en el agua y nosotrose 50μl en lugar de la 20μl de la espermidina. Si usamos la protamina, por lo general se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos en lugar de colocar en el hielo. Protamina no deben mantenerse congelados y es un polvo en lugar de un líquido. </li></ul></li><li> Incubar la mezcla en hielo durante 30 minutos, y periódicamente se mezclan para mantener las partículas de oro en suspensión. A continuación, girar brevemente y aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavar con 300μl etanol al 70%. Girar brevemente. </li><li> Lavar con 1 ml de etanol al 100%. Girar brevemente. </li><li> Resuspender en 170μl etanol al 100%. </li></ol> Preparación de macrocarriers: <ol><li> Enjuague 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en 2-propanol. Ponerlas sobre un papel absorbente y dejar secar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 20μl de la mezcla de ADN / oro en el centro de cada macrocarrier. Asegúrese de hacer vórtice antes de pipetear para mantener el oro en suspensión. </li><li> Deje que el etanol se evapore. </li></ol> 3. Bombardeo Asegúrese de realizar un bombardeo en blanco antes de que el experimento para eliminar el helio en el sistema. <ol><li> Encienda la bomba de vacío y una trampa cerca de la bomba de vacío. Usamos una bomba de vacío libre de aceite. </li><li> A su vez en el tanque de helio. Comprobar que la presión es ≥ 2200psi. </li><li> Disco de ruptura mojado (1350 psi) en 2-propanol, colocando en la retención de la tapa para hepta adaptador. </li><li> Atornillar el adaptador en PDS-1000 del sistema y apriete con la llave de par suministrado. </li><li> Lugar el 7 macrocarriers en el soporte y el asiento con la herramienta suministrada. A continuación, poner una pantalla de detención hepta y el fondo sobre el agricultor. Da la vuelta al titular y colóquelo en el segundo estante de arriba. El lado de oro manchado del macrocarriers debe estar mirando hacia abajo en este punto. </li><li> Alinear los agujeros en la parte superior del soporte macrocarrier con las salidas del adaptador hepta. </li><li> Coloque la placa de redes de próxima generación recubierto de gusanos (de tapa) en el estante más bajo en la cámara de bombardeo. </li><li> Completamente abierto el vacío caudal mando de la PDS-1000. Pulse el botón de vacunas hasta la cámara alcanza los 26 en Hg. Luego cambiar a mantener la posición de mantener el vacío. </li><li> Presione y mantenga presionado el botón de disparo hasta que se rompe el disco. Esto sucederá cuando la presión alcanza 1350psi. A veces esto toma 20.5 segundos en ocurrir. Suelte el botón. </li><li> De liberación de vacío de la cámara (posición de ventilación), y retire la placa. </li><li> A su vez de vacío y de helio. </li><li> El fuego varias veces hasta que la línea no contiene helio (helio indicador debe marcar 0 psi). </li><li> Apague el sistema PDS-1000. </li></ol> Gusano de recuperación después del bombardeo: <ol><li> Dejar la placa bombardeada a 20 ° C durante 20 minutos. </li><li> Flotan los gusanos de la placa con 10 ml de tampón S-basal o M9. </li><li> Poner gusanos 0,5 ml de 20 a 10 cm descubierto placas NGA. </li><li> Deja a 20 ° C de temperatura o ambiente (22-24 ° C) durante aproximadamente 2 semanas antes de comprobar si los gusanos rescatados. </li><li> Pantalla de gusanos con el fenotipo de la UNC-119 (+) con un microscopio de disección. El momento óptimo para la investigación es después de las placas han muerto de hambre ya que los gusanos se han rescatado más de ventaja en la supervivencia no rescató a los gusanos. </li><li> Generar una línea individual de cada placa de 10 cm que contenían gusanos rescatados. </li></ol> 4. Resultados representante El éxito del protocolo en lo que respecta a la obtención de animales transgénicos depende del transgén en particular. Para el promotor: transgenes GFP reportero que hemos obtenido hasta 20 líneas. Un resultado más típico es de 3-10 líneas. Hasta el 30% de las líneas transgénicas son líneas integradas, pero esto es al azar y que llevará a cabo bombardeos múltiples en un solo día, si una línea integrada es especialmente deseada.

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Biolística bombardeo es un método sencillo para introducir ADN extraño en muchos organismos, incluyendo C. elegans 1,5,6,7,16. Se basa en las partículas de oro formando un complejo con el ADN en presencia de CaCl2. Poliaminas catiónicas, tales como la espermidina, proteger el ADN de la degradación de la nucleasa en vivo. Dado que la espermidina es una molécula inestable, es importante guardarla en pequeñas alícuotas a -20 ° C, y que la solución adecuada antes de realizar el bomb...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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		<div>
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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

El número de laboratorios que utilizan el nematodo C. vida libre elegans está creciendo rápidamente. La popularidad de este modelo biológico se atribuye a un tiempo de generación rápida y corta vida, fácil mantenimiento y bajo costo, el genoma secuenciado en su totalidad, y la variedad de recursos de ARN de interferencia y los animales mutantes. Además, el análisis de la C. elegans genoma revela una gran similitud entre los gusanos y los vertebrados superiores, lo que sugiere que la investigación en los gusanos podrían ser un complemento importante a los estudios realizados en ratones enteros o células cultivadas. Una parte muy importante de la investigación y el gusano es la capacidad de utilizar animales transgénicos para estudiar la localización de genes y su función. Los animales transgénicos pueden ser creadas a través de la microinyección de la línea germinal o gusano a través del uso de bombardeos biolística. El bombardeo es una técnica más reciente y menos conocida de una serie de laboratorios. A continuación se describe un protocolo sencillo para generar gusanos transgénicos por el bombardeo con partículas de oro biolística con el Bio-Rad PDS-1000 del sistema. En comparación con microinyección de ADN en la línea germinal hermafrodita, este protocolo tiene la ventaja de no requerir habilidades especiales de los operadores en lo que respecta a la identificación de la anatomía del gusano o la realización de la microinyección. Además varias líneas transgénicas se obtienen generalmente a partir de un bombardeo sola. También a diferencia de la microinyección, el bombardeo biolística produce animales transgénicos con ambas matrices extracromosómico y transgenes integrados. La capacidad de obtener integrada líneas transgénicas puede evitar el uso de protocolos mutagénico para integrar ADN ajeno. En conclusión, el bombardeo biolística puede ser un método atractivo para la generación de animales transgénicos, en especial para los investigadores no están interesados ​​en invertir tiempo y esfuerzo necesario para aprender a microinyección.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en<em&gt; C. elegans</em&gt; La investigación. Descrito es un protocolo simple, pero eficaz, para introducir transgenes en los gusanos usando bombardeo biolística con partículas de oro recubiertas de ADN. El esfuerzo que implica y los resultados de los bombardeos se comparan favorablemente con microinyección para la generación de animales transgénicos.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K vistas.  University of Pittsburgh. Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en C. elegans La investigación. Descrito es un protocolo simple, pero eficaz, para introducir transgenes en los gusanos usando bombardeo biolística con partículas de oro recubiertas de ADN. El esfuerzo que implica y los resultados de los bombardeos se comparan favorablemente con microinyección para la generación de animales transgénicos.

Video: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.