Agradecemos al Sr. Hajime Ichijo por los consejos de grabación en vídeo y útil para la edición de vídeo. También agradecemos a Drs.Yuji Tsunekawa y Yoshizaki Kaichi de tipo asistente para la grabación en vídeo. Este trabajo es apoyado por KAKENHI en B para jóvenes científicos y la ciencia del cerebro áreas prioritarias-molecular de MEXT de Japón. Queremos agradecer el apoyo de Global COE Programa &quot;Centro de investigación básica y traslacional de la Ciencia del Cerebro Global&quot; de MEXT de Japón y la investigación central para la Ciencia Evolutiva y de la Tecnología (CREST) ​​de la Ciencia y la Corporación Japonesa de Ciencia Tecnología japonesa y Tecnología (JST) .

1. La creación del sistema WEC <ol><li> Conjunto de una membrana de 0,22 micras filtro a la entrada del tubo de silicona dentro del sistema de WEC a). </li><li> Abra la válvula de un cilindro de gas que contiene O 2 (95%) y CO 2 (5%). El flujo de la mezcla de gas en el tambor a través de la botella de burbujas que contienen agua esterilizada. </li><li> Ajustar el volumen del flujo de la mezcla de gas de 50 cc. </li><li> Inserte el tubo de silicona a dejar en una botella de agua de salida y el flujo de la mezcla de gases. </li><li> Girar el tambor a la velocidad de 20 rpm / min. </li></ol> 2. Preparación del medio de cultivo <ol><li> Rata descongelar inmediatamente a centrifugar (IC) de suero a 37,0 ° C b). Añadir D-glucosa (2 mg / ml) en suero descongelado en un vaso de precipitados en autoclave 100. El medio de cultivo debe estar preparado a nivel de cultivo primario (por ejemplo, usando una capucha). </li><li> Añadir antibiótico-antimicótico (100X) que el líquido del suero, con 1: 400 dilución. </li><li> Vaporizar isoflurano restantes (debido a la anestesia de las ratas durante la recogida de sangre) en el suero durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) c). </li><li> Esterilizar el medio de cultivo utilizando un filtro de membrana de 0,45 micras. </li><li> Verter 3,0 ml del medio en cada frasco de cultivo y sellar la parte superior de cada botella con un tapón de silicona, cubierta con papel de aluminio (ver ref. 14) d). </li><li> Prepare tres o cuatro placas de Petri que contiene disposición e salina de Tyrode). </li></ol> 3. La anestesia de la rata y el aislamiento del útero <ol><li> Anestesiar a una rata de tiempo del embarazo profundamente con anestésicos por inhalación o por vía parenteral. </li><li> Limpie la zona abdominal de la rata anestesiada embarazadas con etanol al 70%. </li><li> Levante la piel con una pinza y exteriorización de la pared abdominal mediante la reducción de la piel con unas tijeras grandes f). </li><li> Recogida de la pared abdominal con un par de pinzas y hacer en forma de U grandes incisiones longitudinales en la pared abdominal con una tijera grande hasta el nivel torácico g). </li><li> Llevarse el intestino hacia el lado izquierdo con un par de pinzas y exponer un extremo del útero conectado al ovario. </li><li> Levante el extremo del útero con una pinza y corta la posición entre el útero y ovario con unas tijeras de gran tamaño. </li><li> Sacar el útero de la rata embarazada mediante la reducción de la grasa alrededor del útero hasta el otro extremo del útero. </li><li> Transferencia al útero de una placa de Petri que contiene solución salina de Tyrode. </li><li> La eutanasia a las ratas mediante la administración excesiva de anestésicos o la dislocación cervical después de la extirpación del útero. </li></ol> 4. La eliminación de los embriones en el útero <ol><li> Brevemente enjuague el útero en una solución salina de Tyrode y su transferencia a la segunda placa de Petri con un par de pinzas finas h). </li><li> Bajo un microscopio binocular, recoger la pared del útero con una pinza fina y cortar la pared del útero en el lado opuesto a la mesometrio conexión con los vasos sanguíneos con tijeras rectas oftálmica. </li><li> Inserte la punta de la tijera oftálmica recta en el espacio entre la pared uterina y la decidua. Cortar la pared uterina longitudinalmente a lo largo del lado antimesometrial. </li><li> Grupo de la decidua en el lado mesometrial y conceptuses separa del útero con dos pares de pinzas finas i). </li><li> Transferencia conceptuses a la tercera placa de Petri con una pipeta de vidrio esterilizado con un diámetro adecuado. </li></ol> 5. La disección de embriones de rata <ol><li> Inserte una punta de la microforceps en la decidua y hacer una incisión transversal en la decidua en todo el embrión con dos pares de pinzas. </li><li> Inserte las puntas de la pinza en la decidua en el lado de la placenta y hacer dos incisiones longitudinales en la decidua a la cima. </li><li> Retire la decidua placentaria en el lado de desgarramiento que con dos pares de pinzas. Retire la decidua restante con dos pares de pinzas. </li><li> Recoger la membrana de Reichert, hacer una incisión horizontal en ella, y separado de la membrana del embrión en el lado anti-placentaria. </li><li> Haz un pequeño agujero en el saco vitelino, cerca de la cabeza del embrión con los dos pares de pinzas y corta el saco vitelino con un par de tijeras curvas oftálmica. Es importante no dañar los vasos sanguíneos principales. </li><li> Levante el amnios en el sitio alrededor de la cabeza del embrión con los dos pares de pinzas finas, y tire suavemente el embrión desde el saco vitelino por romper el amnios h). El cuerpo del embrión debe ser sacado de la bolsa de la yema para aumentar el suministro de oxígeno para el embrión en la etapa de gestación. </li></ol> 6. Cultivo de embriones todo <ol><li> Comprobar los daños en la placenta, saco vitelino, y la condición de latidos del corazón y la circulación sanguínea. </li><li> Ser consciente de no estirar el cordón umbilical, la transferenciael embrión de un frasco de cultivo con una pipeta de vidrio esterilizado. Aporte de solución salina de Tyrode a las botellas de la cultura debe ser lo menos posible. </li><li> Quitar un tapón de silicona no orificio del tambor rotatorio. Conectar el frasco de cultivo con un tapón con un agujero en el tambor rotatorio del sistema de WEC perpendicularmente. Tenga cuidado de no poner la fuerza en el tambor en direcciones inadecuadas desde el tambor rotatorio es un equipo muy bien. Los frascos que contienen el embrión disecados son transferidos a la cultura de uno en uno, la apertura de la puerta de la incubadora debe ser minimizado para evitar que la temperatura de la incubadora se reduce j). </li><li> Después de 10 horas de la cultura, aumentar el volumen de flujo de la mezcla de gas de hasta 75 cc y hasta 100 cc después de 24 horas (Tabla 1). </li><li> El medio de cultivo se debe cambiar alrededor de 24 horas mediante la transferencia de los embriones cultivados en una botella nueva cultura con el medio recién preparado. Aumentar el volumen de flujo de hasta 125 cc después de 34 horas y hasta 150 cc después de 48 horas (Tabla 1) </li><li> De vez en cuando comprobar el estado de los embriones cultivados por contar el ritmo cardíaco (por ejemplo, 120-150/min es óptimo) y mediante la observación de la circulación sanguínea. Si es necesario contar el número de somitas para juzgar el crecimiento de los embriones en una solución salina de Tyrode. En el desarrollo normal, un somite se agrega en dos horas. </li><li> Cuando WEC haya finalizado la alimentación de la mezcla de gas y desconecte el tubo de entrada y el filtro de membrana para evitar el reflujo en el tubo de entrada de la botella de burbujas. </li></ol> 7. Notas <ol class="lalpha"><li> La temperatura dentro del sistema de WEC se mantiene constantemente en 37.0-37.5 ° C. </li><li> 100% IC rata suero se utiliza rutinariamente en nuestra WEC de embriones de rata y ratón, y se mantiene a -20 ° C antes de su uso. </li><li> Compramos rata IC suero, que se obtiene de las ratas que son anestesiados con isoflurano. </li><li> Botellas desechables también están disponibles en Ikemoto Rika. Botellas y tapones de silicona debe ser esterilizados en autoclave. </li><li> La disección de embriones debe realizarse a temperatura ambiente, porque el mantenimiento de los embriones a temperatura alta o baja durante la disección afectar el desarrollo posterior en el WEC. </li><li> Herramientas para la disección se esterilizan con calor seco. </li><li> La piel y la pared abdominal se debe cortar por separado para evitar la contaminación de los pelos en un plato como sea posible. Cambiamos un par de tijeras grandes y pinzas con un nuevo par de ellos cuando se corta la piel y aislar el útero, respectivamente. </li><li> Con unas pinzas cuyas puntas están muy bien es muy importante para diseccionar los tejidos sin duda. Nos manualmente afilar las puntas de unas pinzas con una piedra y aceite de la máquina. </li><li> Nosotros utilizamos un lado de la pinza como un cuchillo para evitar el exceso de presión a los embriones. </li><li> Cuando la temperatura dentro del sistema de WEC disminuye al abrir la puerta varias veces, seguimos para encender la luz para mantener la temperatura dentro del sistema. </li></ol> 8. Los resultados representativos La figura 1 muestra los procedimientos de la disección de los embriones de ratas y embriones de rata cultivadas. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cultivo de embriones enteros del embrión de rata E12.5. (A) Un embrión disección del útero de las ratas preñadas. (B) La eliminación de la decidua en el lado de la placenta. (C) La eliminación de la membrana de Reichert. (D) La apertura del saco vitelino. (E) La rata de cultivo de embriones en la botella durante 6 horas después del comienzo de la WEC. (F) El embrión de rata en cultivo durante 42 horas. d, decidua, R, la membrana de Reichert, p, la placenta, ys, del saco vitelino; e, embrión. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 horas </td><td> 12 horas </td><td> 24 horas </td><td> 36 horas </td><td> 48 horas </td></tr><tr><td> E12.5 embrión de rata </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 horas) </td><td> 95% de 100 cc </td><td> 95% 125 cc (34 horas) </td><td> 95% de 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Condición óptima de oxígeno.

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6::EGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization.">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

Hay dos pasos críticos en el CME de roedores para el éxito. En primer lugar, el procedimiento de disección debe ser precisa, no para los embriones de los daños, especialmente en los vasos sanguíneos. En segundo lugar, el procedimiento debe ser lo más rápido posible porque el oxígeno y los nutrientes no son suministrados a través de la placenta después del aislamiento del útero. Esto es crítico para mayores embriones. En el caso de las ratas después de WEC E12.5, debemos transferir embriones disecados en fra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td colspan="5"> La creación de WEC </td></tr><tr><td> WEC sistema (10-0.310) </td><td> Herramienta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Otro pequeño modelo también está disponible. </td></tr><tr><td> Silicio enchufe sin un agujero </td><td> Herramienta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Cilindros de gas mezcla </td><td> Herramienta </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Que contiene 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. La orden de encargo. </td></tr><tr><td> Regulador de gas </td><td> Herramienta </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micras filtro Millex GS </td><td> Herramienta </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestesia y aislamiento del útero </td></tr><tr><td> Tijeras grandes </td><td> Herramienta </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Herramienta </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Eliminación de placa de Petri (90 mm x 15 mm) </td><td> Herramienta </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Profundidad de tipo plato es el mejor para la disección. </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Reactivo </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Para la anestesia </td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Reactivo </td><td> Schering-Plough Animal Health </td><td> - </td><td> Para la anestesia </td></tr><tr><td> Tyrode solución salina </td><td> Reactivo </td><td> - </td><td> - </td><td> Según el protocolo en la referencia. 2. Guardar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Cronometrada embarazadas ratas Sprague-Dawley </td><td> Animal </td><td> Carlos Ríos Laboratorios Japón </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Preparación del medio de cultivo </td></tr><tr><td> Cultura botella de vidrio </td><td> Herramienta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Disposición frasco de cultivo </td><td> Herramienta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Silicio enchufe con agujero </td><td> Herramienta </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Lámina de aluminio </td><td> Herramienta </td><td> Cualquier empresa </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Bolsa de autoclave </td><td> Herramienta </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Para las botellas de la cultura </td></tr><tr><td> Bolsa de autoclave </td><td> Herramienta </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> De tapones de silicona </td></tr><tr><td> 0,45 micras filtro Millex HA </td><td> Herramienta </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> Tubo cónico de 50 ml </td><td> Herramienta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Vaso de 100 ml </td><td> Herramienta </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rata IC suero </td><td> Reactivo </td><td> Carlos Ríos Laboratorios Japón </td><td> - </td><td> Se refieren a: el Sr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336, Fax: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosa </td><td> Reactivo </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Los antibióticos líquidos antimyotic </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> La disección de embriones </td></tr><tr><td> Oftálmica recta tijeras </td><td> Herramienta </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Para el corte de la pared uterina </td></tr><tr><td> Oftálmica tijeras curvas </td><td> Herramienta </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Para el corte del saco vitelino </td></tr><tr><td> Pinzas # 5 </td&gt; <td> Herramienta </td><td> Vigor </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas # 5F </td><td> Herramienta </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta </td><td> Herramienta </td><td> - </td><td> - </td><td> Hecho a mano con pipeta Pasteur. </td></tr><tr><td> Bolsa de autoclave </td><td> Herramienta </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Para pipetas de vidrio </td></tr><tr><td> Microscopio binocular </td><td> Herramienta </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Luz </td><td> Herramienta </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Aceite de piedra </td><td> Herramienta </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Para el afilado de las pinzas </td></tr><tr><td> Aceite de máquina </td><td> Herramienta </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Para el afilado de las pinzas </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

Toda una cultura de embriones (WEC) técnica ha sido desarrollada en 1950 por nuevas y sus colegas, y se aplica para la biología del desarrollo 1. Aunque el desarrollo y el crecimiento de los embriones de mamíferos son críticamente dependientes de la función de la placenta, la técnica del CME de ratón nos permite la cultura y la condición de embriones de rata ex vivo durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación durante el día embrionario (E) de 6.5 E12.5 en el ratón o E8.5-E14.5 en la rata 2, 3, 4. En WEC, podemos directamente de destino deseado áreas de embriones utilizando finos capilares de vidrio porque los embriones pueden ser manipulados bajo el microscopio. Por lo tanto, el CME de roedores es una técnica muy útil cuando queremos estudiar los procesos dinámicos de desarrollo de los embriones de mamíferos postimplanted. Hasta la fecha, varios tipos de sistemas de CME han sido desarrollados 1. Entre ellos, el sistema rotatorio botella-el tipo de cultivo es el más popular y apto para el cultivo prolongado de embriones en mitad de la gestación, es decir, después de E9.5 y E11.5 en el ratón y la rata, respectivamente 1. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de WEC ratas después de E12.5 con un modelo perfeccionado del sistema original de los rotadores, que fue diseñado por nuevos y Cockroft 5, 6, y la introducción de diversas aplicaciones de la técnica del CME para los estudios en mamíferos de desarrollo la biología.

Watch this Scientific Journal Video about The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System at JoVE.com

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Toda técnica de cultivo de embriones de ratón nos permite la cultura y embriones de rata<em&gt; Ex vivo</em&gt; Condición durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de cultivo de embriones de ratas después de todo E12.5 utilizando el sistema de botella de los rotadores, el tipo de cultivo.

El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K vistas.  Tohoku University Graduate School of Medicine. Toda técnica de cultivo de embriones de ratón nos permite la cultura y embriones de rata Ex vivo Condición durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de cultivo de embriones de ratas después de todo E12.5 utilizando el sistema de botella de los rotadores, el tipo de cultivo.

Video: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto