Este método será fundamental para entender la gastrulación a lo largo de una formación en mamíferos. Al permitir la experimentación en embriones vivos durante etapas embrionarias que durante mucho tiempo han estado ocultos dentro del útero materno. Permite, continúa el crecimiento eficiente y apropiado de embriones de ratón fuera del útero durante un período prolongado de hasta 6 días.
La disección embrionaria rápida y adecuada y la pregastrulación de la concentración y presión del gas son los pasos más críticos para el crecimiento exitoso del embrión. Para comenzar a cultivar embriones de ratón de 7,5 días de edad o más avanzados, encienda el rotador y la unidad de calentamiento del sistema de incubadora de cultivo con rodillos durante al menos 1 hora antes de las disecciones embrionarias. Además, agregue agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida.
A continuación, encienda el módulo regulador de gas presionando el interruptor principal, luego use los controladores respectivos para establecer los valores de oxígeno y dióxido de carbono en 5% Abra el regulador de gas y mueva el interruptor de voltaje en el transmisor de presión para establecer la presión de gas a aproximadamente 6.5 a 7 libras por pulgada cuadrada. Confirme el valor de la presión del gas mediante un manómetro digital. Controle el flujo de gas comprobando la tasa de burbujas creadas dentro del tubo de ensayo lleno de agua de salida asignado dentro de la incubadora de precisión.
Ajuste la velocidad de burbuja adecuada cerrando o abriendo la válvula de flujo de gas en la tapa de la botella de agua. Asegúrese de que el flujo de gas permita la formación de burbujas a una velocidad de 2 a 4 burbujas por segundo o establezca el flujo de burbujas en el primer punto donde el burbujeo sale al tubo de salida lleno de agua. A continuación, llene las botellas de cultivo con 2 mililitros de medio de cultivo.
Use los tapones de silicio ahuecados para sellar las botellas y conéctelos al tambor giratorio hueco para un preequilibrio durante 1 hora. Mantenga los espacios vacíos en el tambor giratorio sellados con los bungs sólidos. A continuación, diseccionar los embriones de una ratón hembra embarazada sacrificada.
Limpie el abdomen con etanol al 70% y corte la piel y la pared abdominal con tijeras. Localice un extremo del útero y corte en la intersección entre el ovario y el útero. Continúe cortando a lo largo del útero hasta el otro extremo y transfiéralo a una placa de Petri de 100 milímetros llena de DPBS.
Lave rápidamente los conceptos en DPBS y córtelos en pares para facilitar el manejo de embriones. Mueva todos los pares de conceptuses a un medio de disección preequilibrado en una placa de Petri de 60 milímetros, luego corte en los conceptuses individuales. A continuación, usando un par de fórceps gruesos, retire la pared uterina de los conceptuses rasgando el tejido uterino, luego usando fórceps microquirúrgicos finos, corte la punta de la decidua en forma de pera.
Inserte los fórceps junto al embrión paralelos a su eje largo y abra los fórceps para dividir la decidua en mitades. Finalmente, usando fórceps finos, agarre el embrión de la decidua y pele el saco de yema parietal del embrión, dejando el cono ectoplacentario intacto unido al cilindro del huevo. Seleccione los embriones en la placa neural, o etapa temprana del pliegue de la cabeza, que no muestran daño en el epiblasto.
Transfiera de 5 a 6 embriones seleccionados por botella a las botellas de cultivo de vidrio preequilibradas y coloque las botellas en el sistema de cultivo rotativo a 37 grados centígrados, en una atmósfera de 5% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Para cultivar embriones y placas estáticas de pregastrulación y gastrulación temprana, agregue 250 microlitros de medio de cultivo de embriones exuterino recién preparado a cada pocillo de una placa de 8 pocillos. Coloque las placas dentro de una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius para el pre-equilibrio.
Después de diseccionar los embriones fuera del útero como se demostró anteriormente, transfiera los embriones individuales a cada pozo de la placa de 8 pocillos usando una micro pipeta y coloque la placa dentro de la incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Tome una imagen de los embriones bajo un microscopio estereoscópico y seleccione para el cultivo solo aquellos con una cavidad amniótica bien formada sin daño evidente y sin la membrana de Reichert. Las condiciones de cultivo con rodillos descritas en este protocolo para embriones de 7,5 días de edad apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia media cercana al 75% después de 4 días de cultivo.
La eficiencia del desarrollo embrionario varía a través de diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta. La suplementación con HBS en lugar de HCS produce una eficiencia de aproximadamente el 68% después de 4 días de cultivo. El desarrollo de 6,5 embriones y placas estáticas se recapitula correctamente con una eficiencia de más del 90% utilizando medio de cultivo embrionario ex-útero con HCS y HBS.
Los cultivos a partir de embriones pregastrulantes muestran una eficiencia del 46% del desarrollo adecuado hasta la etapa temprana de somita y casi el 17% de los embriones completan el desarrollo adecuado después de 6 días de cultivo. La morfogénesis y el desarrollo tisular proceden adecuadamente hasta 42 somitas. Aquí se muestran los defectos de desarrollo representativos observados en embriones para cultivos iniciados a partir del día embrionario 7.5, 6.5 y 5.5.
Los embriones con daños menores en el epiblasto o los embriones que retienen la membrana de Reichert deben descartarse. Los embriones tempranos no crecerán adecuadamente o mostrarán retrasos severos en el desarrollo, mientras que la unión del epiblasto embrionario a la superficie de la placa causará el fracaso de un mayor desarrollo embrionario. Las principales anomalías observadas en embriones defectuosos son el desarrollo de la región posterior fuera del saco vitelino o defectos en el crecimiento de los pliegues neurales.
En cultivos desarrollados a partir de embriones de 5,5 días de edad se observan con frecuencia un defecto de desarrollo es la presencia de un epiblasto pequeño y subdesarrollado. Usando este método, los investigadores pueden realizar una variedad de manipulaciones físicas o químicas en el desarrollo de embriones postimplantados. Por ejemplo, manipulación, trasplante celular o rastreo de linaje.
Este método no solo allana el camino para estudiar el desarrollo postimplantacional de ratón con gran detalle, sino también para implementar métodos de cultivo similares en embriones de otras especies, como el humano.
