Nos gustaría agradecer a jactes Sharon para discusiones interesantes y muchas Novitch B. para el tipo de regalo que los anticuerpos FOXP1. Este trabajo financiado por una beca de la Fundación Wellcome a KCT y una subvención para el proyecto de la Wellcome Trust para SRP (Grant número de referencia 094399/B/10/Z).

1. Haga soluciones necesarias <ol><li> Tampón fosfato 1 M:. Pesar 109,4 g de Na 2 HPO 4 y 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, mezclar y disolver en agua hasta un volumen total de 1 litro. </li><li> Tampón fosfato salino (PBS): Preparar tampón de fosfato 0,1 M, 0,15 M NaCl. 100 ml de PBS debería ser suficiente para el tratamiento de las rebanadas de 10 embriones. </li><li> Agarosa: Heat solución de PBS a alrededor de 70 ° C y añadir sólidos de baja temperatura de fusión de agarosa lentamente mientras se agita continuamente. Hacer la solución a una concentración final de 4% (w / v) de agarosa. Hacer un stock de 50 ml de esta solución. Agregar esta solución en un baño de agua mantenido a 48 ° C hasta que se necesite. Cualquier solución de agarosa no utilizada después del experimento se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. </li><li> Anticuerpo solución bloque: Añadir suero de ternera fetal y triton X-100 al final de una concentración de 1% (v / v) de suero fetal de ternera, 0,1% (v / v) de Triton X-100 en PBS. 10 ml de solución de bloqueo será suficiente para la inmunotinción de 5 diapositivas de las secciones de criostato. </li><li> Fijador: Preparar 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) de paraformaldehído (PRECAUCIÓN). Para preparar la cantidad de calor requerida fijador de agua a 70 ° C, se añade NaOH concentrado a la concentración final requerida, añadir paraformaldehído sólido y mezclar hasta que se disuelva. Enfriar en hielo a 4 ° C. 10 ml de esta solución será suficiente para 20 pocillos de rebanadas de embriones. </li><li> Solución de sacarosa: Preparar 10 ml de una solución de sacarosa al 30% (w / v) conteniendo 0,1 M de tampón fosfato. 10 ml de esta solución será suficiente para 10 pocillos de rebanadas de embriones. </li><li> 70% (v / v) de etanol. Diluir 70 ml de etanol absoluto con 30 ml de agua. </li><li> Medio de Cultivo: Se prepara una solución de extracto de pollo 1% embrión, 1% penicilina / estreptomicina, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoethanol, 4% suero de pollo, 2% suplemento B27 y 100 ng / ml de factor de crecimiento ciliaryneurotrophic (CNTF) todo diluido en medio neurobasal; preparado en hielo y utilizarse el mismo día. 10 ml de medio de cultivo se requiere para 20 pocillos de rebanadas de embriones. </li></ol> 2. Polluelo Preparación de Embriones <ol><li> Coloque los huevos de gallina fertilizados con el lado más largo horizontalmente en un proyecto incubadora forzado a 38 ° C hasta que se desarrollan a la etapa 15 24. Esto normalmente requiere aproximadamente 4 días de incubación. </li><li> En el segundo día de incubación, esterilizar la cáscara del huevo, limpiando con un pañuelo de papel empapado en 70% de etanol. Perforar cuidadosamente el extremo plano de la cáscara del huevo usando una aguja de calibre 21 unida a una jeringa de 5 ml y 5 ml de eliminar la albúmina. Esto reduce el embrión lejos de la cáscara de modo que el embrión no se daña cuando la carcasa está abierta. Devolver los huevos a la incubadora y se incuban durante 2 días. </li><li> Usando romo dumont º 5 fórceps carefully perforar la parte superior central de la carcasa y retire alrededor de 9 cm 2 de shell. Corte alrededor del embrión y cuidadosamente saque el embrión y el lugar en HBSS durante la disección. Los embriones se organizaron de acuerdo a Hamburger y Hamilton (1992) 15. Todos los embriones utilizados deben estar en estrecha a la etapa 24. Los embriones que presentaban ningún signo de anormalidad debe desecharse. </li><li> Retire la membrana amnios, membrana corio-alantoidea, la cabeza, y alantoides con dos Dumont # 5 fórceps. Eviscerar el embrión para eliminar todos los órganos internos. Para ello, cortar la línea media ventral del embrión con unas tijeras de disección micro, mantenga el embrión en la región rostral del tronco con un par de pinzas, agarre la parte rostral del intestino y el corazón y tirar caudalmente. Es importante que esto se realiza limpiamente. Usted debe ser capaz de ver el embrión somitas claramente. Cortar el embrión por la mitad, transversalmente entre el buds.Now miembro superior e inferior del cuerpo recortar torácicapared usando tijeras de microdisección. </li></ol> 3. Preparación de embriones Slice <ol><li> Quitar la solución de agarosa del baño de agua. Cortar 5 cm de la parte inferior de un 3 ml desechable de plástico pipeta Pasteur. </li><li> Retire con cuidado la parte lumbar del embrión disecado con dos pinzas para acunar el embrión de la solución de disección y colocar en un lugar seco placa de Petri. Con la pipeta de Pasteur, eliminar alrededor de 2 ml de agarosa, pipeta de aproximadamente 0,5 ml en la parte superior del embrión y luego aspirar la rebanada embrión en la pipeta. La transferencia del embrión y la agarosa a una cáscara de molde de plástico lejos tener cuidado de no introducir burbujas en la agarosa. Baje suavemente el embrión a la parte inferior de la agarosa en el molde de plástico con la sección torácica hacia abajo. El embrión se deben colocar para ser recta usando una aguja de calibre 21. Las rodajas contendrá también parte de la extremidad en desarrollo y es importante que la orientación del embrión en el agarose lo permitirá. Coloque el bote en el hielo para fijar la agarosa. Tenga cuidado de que el embrión no cambia la orientación durante este período (alrededor de 2 minutos). </li><li> El Leica VT1000S vibratome (Speed ​​3, frecuencia 4, 400 rebanadas gruesas micras) debe ser configurado con la cámara de corte llena de HBSS y rodeado de agua helada. El bloque de agarosa es entonces pegado a la plataforma de vibratome con pegamento. El bloque de agarosa se recorta con una cuchilla de afeitar para dejar la pieza embrión con 1-3 mm de agarosa que lo rodea. Las rodajas que incluyen secciones extremidades brote con una clara apical ectodérmica Rigde se seleccionan y estos trozos se colocan luego en HBSS. En general, hay sólo una o dos rebanadas adecuados por embrión. Retire suavemente la agarosa en torno a los cortes de tejido con dos agujas. Es esencial que esto se hace a fondo y cuidadosamente. </li></ol> 4. Slices Cultivo de embriones <ol><li> Añadir 500 ml de solución de cultivo (descrito anteriormente) a la requiriendoed número de pocillos de un 24-así de ultra baja unión tratada placa de cultivo de tejido. Transferir las rebanadas con cuidado de la solución de HBSS en el pozo. En general, tratamos de tener dos o tres cortes en cada pocillo. Colocar la placa de 24-bien en el cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas. </li></ol> 5. Seccionamiento los segmentos para inmunotinción <ol><li> Tras el período de cultivo, añadir 500 l de solución no tamponada a cada pocillo de las rebanadas de embriones y dejar en hielo durante 20 min. La solución total se retiró cuidadosamente y tres lavados con PBS se llevó a cabo, con intervalos de 5 minutos. Las rodajas se deja entonces en solución de sacarosa a 4 º C, hasta que el disipador rodajas, alrededor de 6 horas pero se puede dejar durante más tiempo (por ejemplo durante la noche). </li><li> Retire las rodajas y dab off solución de sacarosa extra y equilibrar en alrededor de 1 de octubre ml por alrededor de 5 min a 20 ° C. Monte cada plano rebanada en un molde de octubre lleno de pelar lejos de plástico.Después del montaje, colocar los moldes verticalmente en hielo seco a solidificarse. </li><li> Montar los bloques de octubre en el criostato y equilibrar los bloques a -24 º C durante alrededor de 20 min. Corte cada rebanada con 15 mm secciones montadas en Superfrost-Plus diapositivas. Diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C hasta que se necesiten. </li></ol> 6. Inmunofluorescencia <ol><li> Pipetear 1-2 ml de PBS en los portaobjetos horizontales mantenidos en una cámara humidificada con los portaobjetos obtenidos de la parte inferior de la cámara (se utiliza 1 o 2 ml pipetas de plástico fijadas con cinta de autoclave). Se incuban las secciones en PBS durante 5 min a 20 ° C para eliminar el exceso de octubre Eliminar la solución de PBS de la diapositiva y añadir 500 ml de solución de bloqueo sobre las secciones, incubar durante 30 min a 20 ° C. Eliminar la solución de bloqueo y añadir inmediatamente 500 ml de anticuerpo primario diluido añaden a las diapositivas, se incuba a 4 º C durante 18-22 h. </li><li> Elimine la solución de anticuerpo primario y fue inmediatamenteh los portaobjetos con 1 ml de PBS durante 5 min, tres veces a 20 ° C para eliminar el exceso de solución de anticuerpo primario. Añadir 500 ml de anticuerpo secundario diluido a lo largo de las secciones. Los portaobjetos se dejó a 20 ° C durante 30 min. La solución de anticuerpo secundario se retira entonces y el portaobjetos se lavaron 3 veces 5 min en PBS a 20 ° C. </li><li> Después de estos lavados, eliminar el lavado final con PBS, limanda el borde del portaobjetos para eliminar el exceso de PBS, añadir dos gotas de Vectashield en las diapositivas y colóquela suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre las secciones, evitando la formación de burbujas. Eliminar el exceso de Vectashield por transferencia desde el borde de los portaobjetos antes de formación de imágenes. </li></ol> 7. Proyección de imagen <ol><li> Imagen de las secciones immunostained. Nosotros usamos un microscopio Nikon Eclipse E80i fluorescencia equipado con una cámara ORCA ER Hamammatsu digital y 10 X, 40 X 20X y lentes objetivo. </li></ol>

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Ninguno de los autores que compiten intereses o conflictos de intereses.

El protocolo aquí descrito permite una rebanada de embrión de pollo que se incubaron durante más de un día, manteniendo las neuronas motoras vivo y continuo a migrar durante el período de cultivo. En la aclaración de las condiciones para mantener las neuronas motoras vivas, se han identificado varias características clave requeridas. Parece que hasta un 4% de suero de pollo es crítico para la supervivencia de las neuronas motoras y su sustitución con suero de una especie diferente no es tolerada. Curiosamente, hemos encontrado que la presencia de mayores concentraciones de suero fueron perjudiciales para las rebanadas, ya que promueven el crecimiento excesivo del tejido dando lugar a graves distorsiones en la forma de rebanada. Más importante aún, la presencia de factor neurotrófico ciliar también resultó crítica. Sigue siendo una clara posibilidad de que las rebanadas pueden ser capaces de ser cultivadas durante bastante más tiempo que sólo 24 hr, incluso permitiendo la visualización de la información sensorial aferente a la médula espinal. Además, el cultura condiciones también podrían ser útiles para cortar las culturas del tronco cerebral y el mesencéfalo desarrollo / cerebelo. Quizás el mayor beneficio potencial en el uso de estas condiciones de cultivo rebanada es que facilitan la posibilidad de que la manipulación farmacológica de función de la proteína mientras que se minimiza el potencial de efectos adversos en el resto del embrión, tales como el corazón. Un gran número de inhibidores y agonistas de diferentes vías de señalización se puede utilizar para evaluar la migración de los diferentes subtipos de neuronas espinales y, potencialmente, su efecto de la formación de circuitos locales espinales durante el desarrollo. Además, algunas perturbaciones genéticas de expresión de la proteína, tales como los que hacen uso de siRNAs y oligonucleótidos de morfolino, sufren del hecho de que sólo puede ser introducido en el desarrollo temprano (debido a las limitaciones en los procedimientos de electroporación in ovo) y los efectos sólo duran un corto período de time (generalmente un día). Nuestra cultura rebanada se inicia en etapas posteriores y ofrece la posibilidad de utilizar esta tecnología en el desarrollo posterior en la etapa de corte para ver sus efectos durante el período de la cultura de la rebanada. El protocolo de cultivo de cortes también podría permitir la visualización de ambas motoneurona espinal, así como la migración de interneuronas dorsal en tiempo real a través de microscopía de vídeo time-lapse. Esto podría conseguirse mediante microscopía de contraste de fase con luz blanca o mediante el uso de imágenes de fluorescencia. Si esta última técnica se iban a utilizar a continuación, la introducción de marcadores fluorescentes que se necesita. Esto puede lograrse ya sea mediante la introducción de tintes fluorescentes tales como Dil o DiO a través de cualquiera de marcado retrógrado de la extremidad o etiquetado anterógrada desde el ventrículo o la electroporación in ovo de constructos para conducir las proteínas fluorescentes en un subconjunto de neuronas.

Durante el desarrollo embrionario normal, muchos tipos de células diferentes que se generan deben migrar desde su punto de origen hasta donde eventualmente funcionarán en el organismo maduro. Dentro de la médula espinal en desarrollo, las células progenitoras se encuentra en la zona ventricular en la línea media y generan muchos subtipos de neuronas postmitóticas y células gliales que deben migrar a integrarse en los circuitos neuronales funcionales requeridos para el procesamiento sensorial y la salida del motor 1. Las neuronas motoras espinales que controlan la contracción de músculos de las extremidades se han estudiado ampliamente y se sabe mucho de las moléculas y mecanismos que conducen a la formación de sus subclases diferentes. Sin embargo, se sabe mucho menos de los mecanismos por los cuales las neuronas motoras migran, segregar y recibir entradas sinápticas. Motor identidad subtipo neuronal se adquiere durante el desarrollo de una manera jerárquica. Motor subtipos neuronales pueden ser ampliamente clasificados inPara distintas columnas, las divisiones y las piscinas que se definen por sus proyecciones axón. Motor columnas axones de proyectos a cualquiera de los músculos axiales, viscerales o la integridad física. Divisiones de motor subdividir la extremidad proyección de las neuronas motoras de la columna lateral del motor (LMC) en los que se proyecta a los músculos ventral o dorsal 2. Dentro de las divisiones, grupos de neuronas motoras motor denominado proyecto piscinas a los músculos individuales en el miembro 2, 3. Salientes de extremidad neuronas motoras se definen por su expresión del factor de transcripción FOXP1 4, 5, mientras que la identidad de división se caracteriza por la expresión de los factores de transcripción del homeodominio 1 Islet-(ventralmente proyección) o LHX 1-(dorsalmente proyectando) 6. En efecto, LHX-1 de expresión se requiere para las proyecciones apropiadas dorsal de las neuronas motoras 7. Cada uno de estos subtipos de ocupar distintas posiciones dentro de la médula espinal, las neuronas motoras ventrales proyectan venir a residir a medial dorsal projecting neuronas motoras. Esto resulta en la LMC siendo segregados en los llamados LMCmedial (LMCM) y divisiones LMClateral (LMCl). Organización piscina Divisional y el motor se adquiere en dos fases 8. En la primera fase, la segregación de división se consigue a través de una migración de las neuronas motoras en una característica medial a lateral de la moda. Las células LMCl se generan después de las células y así LMCM LMCl migra a través de la LMCM para alcanzar su posición de sedimentación final. La segunda fase se lleva neuronas motoras dentro de una división y agrupaciones ellos en conjuntos de neuronas motoras, presumiblemente a través de una clasificación dorsal-ventral de las neuronas motoras. Los miembros de la familia de las cadherinas catenina dependientes clásica han demostrado ser crucial para las dos fases de la neurona motora 8-10 organización. Sin embargo, como función de las cadherinas controla el movimiento celular se conoce bien. La adquisición de la identidad columnar, de división y de piscina requiere que el patrón de señales extrínsecas intrínsecamentec expresión de factores de transcripción 11. Además, alrededor de 50% de todas las neuronas motoras mueren por apoptosis durante el desarrollo normal en un proceso que requiere señales extrínsecas de la extremidad, en gran parte a través de soporte neurotrófico de motor supervivencia de las neuronas. Por lo tanto, las neuronas motoras de desarrollo requiere un entorno adecuado que se mantenga en un timecourse relativamente largo. Por esta razón, los aspectos prácticos de la generación de cultivos de cortes de médula espinal para mantener la supervivencia de las neuronas del motor requieren la elucidación de las condiciones de cultivo apropiadas. Anterior cultivos de cortes de embriones se han utilizado para seguir el comportamiento de extrínsecamente añadido purificado poblaciones neuronales 12-14. Sin embargo, para nuestros conocimientos Condiciones de cultivo que facilitan in situ motor supervivencia neuronal y la migración dentro de la propia división no se han publicado. Hemos modificado una condición de cultivo estándar que facilita la supervivencia de purificada, disociadas neuronas motoras craneales para facilitar motor neurona desarrollo dentro de un sistema de cultivo de embriones rebanada. También supervisó la colocación de las neuronas motoras supervivientes y demostrar que las posiciones en gran parte normal de la división de la motoneurona se adquiere durante el período de cultivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Huevos </td><td> Henry Stewart Farms, Reino Unido </td><td></td><td> Los huevos fecundados de gallina Brown Bovan Gold Farms (Henry Stewart, Reino Unido), almacenados a 14 ° C hasta que la incubación </td></tr><tr><td> Aguja de calibre 21 </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml jeringa </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont fórceps </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tijera de disección </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3,5 en directo) </td></tr><tr><td> Moldes de embriones incrustación: Despegue moldes </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> De forma piramidal 22 mm a 12 mm </td></tr><tr><td> Super Glue </td><td></td><td></td><td> Power Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Sodio di-hidrógeno fosfato, mono-hidrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio mono-hidrógeno fosfato </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Baja temperatura de fusión de agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de Sodio </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Plástico desechables pipetas pasteur </td><td> Elkay Precision laboratorio consumibles </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml de volumen </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrógeno carbonato de sodio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de embrión de pollo </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina solución </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina solución </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Southern Grupo Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de CilliaryNeurotrophic (CNTF) </td><td> Sistemas R y D </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Polluelo Suero </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Los anticuerpos primarios </td><td></td><td></td><td> fueron adquiridos de Desarrollo del Banco hibridoma Estudios, con la excepción de anticuerpos anti-FOXP1, que eran una especie de regalo de Bennett Novitch de UCLA. Diluciones de anticuerpos primarios fueron de conejo anti-FOXP1 (1/32000), ratón anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FOXP1 (1/1000). Todos los anticuerpos fueron almacenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Los anticuerpos secundarios </td><td></td><td></td><td> Burro anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) adquiridos de Jackson Laboratories Inc. Immunoreseach burro anti-ratón (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-conejo (Alexa Fluor 594) (1:1000) adquirido de Invitrogen Todos los anticuerpos fueron almacenadas a 4 ° C. </td></tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Corning Costar </td><td> 3473 </td><td> accesorio ultra bajo 24-así placa </td></tr><tr><td> Octubre </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura óptima de corte </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield medio de montaje fluorescente </td></tr><tr><td> Diapositivas </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> Superfrost-Plus portaobjetos cargados positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Cubierta de cristal </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 mm </td></tr><tr><td> Obligado el proyecto incubadora: </td><td> Lyon Electric Company </td><td></td><td> mantenerse húmedo, garantizando los niveles de agua siempre es suficiente, mantenida a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, Reino Unido </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubadora </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscopio de fluorescencia </td></tr><tr><td> Cámara Digital </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M y Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

Cultivos de cortes puede facilitar la manipulación del desarrollo del embrión y farmacológicamente tanto a través de manipulaciones genéticas. En este sistema de reducción, los potenciales efectos secundarios letales debido a las solicitudes de fármacos sistémicos pueden ser superados. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que avanza el desarrollo normales dentro del entorno reducido de la rebanada. Nos hemos centrado en el desarrollo de la médula espinal, en particular la de las neuronas motoras espinales. Hemos variado sistemáticamente las condiciones de cultivo de las rebanadas de embrión de pollo desde el punto en el que las neuronas motoras espinales más había nacido. Analizamos el número y tipo de las neuronas motoras que sobrevivieron durante el período de cultivo y la posición de las neuronas motoras en comparación a que in vivo. Se encontró que el tipo de suero y factores neurotróficos se requiere durante el período de cultivo y fueron capaces de mantener las neuronas motoras vivo durante al menos 24 horas y permitir que las neuronas motoras a migrar a las posiciones adecuadas en lamédula espinal. Presentamos estas condiciones de cultivo y la metodología de preparación de los cultivos de cortes de embriones con embriones de pollo eviscerado embebidos en agarosa y en rodajas con un vibrátomo.

El uso de rodajas cultivadas para seguir el desarrollo de las neuronas de proyección interneuron y ha tenido influencia en el progreso de nuestra comprensión de la generación de organización dentro de la corteza 16. En la médula espinal, el desarrollo motor neurona se ha seguido usando cultivos de embriones de pez cebra enteros 17. Sin embargo, la columna vertebral de la neurona motora organización en el pez cebra es relativamente simple (debido a la falta de grandes músculos de las extremidades en el pescado). Los mecanismos moleculares que conducen a una jerarquía de organización de las neuronas motoras espinales durante el desarrollo de los vertebrados superiores están actualmente poco conocidos. Las condiciones de cultivo que facilitan la supervivencia neuronal y la migración cuerpo celular en cultivos de corte de embrión de los vertebrados superiores tanto, se requieren. En la actualidad, la médula cultivos de cortes de médula de los vertebrados superiores se han utilizado para las neuronas disociadas de semillas en la parte superior de las rebanadas 12-14, investigar los axones marcados con fluorescencia en la periferia de la rebanada18, o de la conducta de las células progenitoras en el desarrollo temprano de la médula espinal 19. Cortar las condiciones de cultivo para los cables más tarde espinales, en particular aquellos que mantienen el desarrollo de la neurona motora se carece actualmente. Para tratar de seguir el desarrollo neuronal espinal, particularmente la de las neuronas motoras espinales, investigamos diversas condiciones de cultivo que podrían promover la supervivencia neuronal motor y la adquisición de la orden inicial en la organización de motor a través de la migración lateral de las neuronas. Los ensayos iniciales con la etapa 18 a la etapa de embrión de pollo 20 rebanadas de médula espinal fueron infructuosos, nosotros no fuimos capaces de mantener las neuronas motoras con vida durante más de unas pocas horas y no pudieron demostrar la generación de un número importante de células LMCl durante el período de cultivo (datos no se muestra). Por ello, investigó los cultivos de cortes de la etapa 24 embriones, un punto de tiempo cuando la mayoría de las neuronas LMCl y LMCM se han generado, pero cuando LMCl neurona migración está todavía en su infancy (Figura 1a-c). Esta migración lateral de las neuronas LMCl está prácticamente terminada por la etapa 27, a unos 24 a 36 horas más tarde (Figura 1 df). Nuestro ensayo tanto, podría ser simplificado para ser capaz de mantener las neuronas vivas y para facilitar su migración lateralmente en el asta ventral. Empezamos nuestros experimentos con condiciones de cultivo relativamente simples que contienen sólo Hank de solución salina equilibrada con o sin suero de pollo o extracto de embrión de pollo. En todos los casos, a pesar de que hemos sido capaces de mantener las neuronas LMC en el sector, encontramos poca evidencia de neuronas LMCl objeto de mantenimiento (al menos por la expresión de LHX-1). Además, encontramos expresión inapropiada de genes tales como HB9 en la médula espinal dorsal, una situación que no se produce in vivo (datos no mostrados). Así, estas condiciones de cultivo simples no son adecuados para la investigación de la adquisición de motor organización de las neuronas. Así buscó a conditio más complejons y como una base que se utiliza una formulación que se ha publicado para facilitar la supervivencia de las neuronas disociadas de embriones de pollo de motor craneales. Esta condición 20 (1% de extracto de embrión de pollo, 1% Pen Strep, 0,35% de L-glutamina, 0,1% de 2-mercaptoetanol, 2% de suero de caballo, 2% de suplemento B27 y 50 ng / ml de factor de crecimiento ciliaryneurotrophic (CNTF) en medio neurobasal (aquí llamado Guthrie medio) se mantenga más neuronas motoras vivas que los medios más simples. Además, no dio lugar a la expresión de factores de transcripción espurio en la médula espinal dorsal. Sin embargo, la supervivencia de las neuronas LMCl era pobre (Figura 1 gi, p). lo tanto, variar lo que consideran factores clave en el medio de Guthrie, a saber, el animal de origen del suero, la concentración del suero y la concentración de CNTF en el medio. Hemos encontrado que cambiando el suero a partir de suero de caballo en Chick suero y un aumento de la concentración de CNTF a partir de 50 ng / ml a 100 ng / ml aumentó sustancialmente tque la supervivencia de las células LMCl y LMCM y también permite su migración en el cuerno ventral sobre la hr 24 de las condiciones de cultivo (Figura 1 jl, p). El número total de neuronas motoras, la relación de LMCM a LMCl y, de hecho, la migración de las células LMCl en el cuerno ventral parecían muy similares a las secciones de embriones que se había permitido desarrollar in ovo en lugar de en el cultivo de cortes (figura 1 ko, p). Por lo tanto, creemos que, basándose en el número de células factor de transcripción expresión, y la posición de las neuronas motoras, nuestras condiciones de cultivo rebanada normal de recapitular el desarrollo neurona motora espinal al menos durante un período de 24 horas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Situación de la generación de LMC (FOXP1 tinción enb) y LMCl (LHX-1 tinción en a) en la etapa 24. c es una fusión de los dos canales. La línea media se muestra como una línea de puntos en A y D, V muestra la orientación de la dorsoventral (D, V), el eje de la médula espinal d -. F. . Situación de la LMC (FOXP1 tinción en d) y LMCl (LHX-1 tinción en e) organización en la etapa 27 f es una combinación de los dos canales g -. I. Lhx-1 (g) y FOXP1 (h) de expresión en secciones de una rebanada cultivaron en un medio que soporta craneal motor supervivencia de células neuronales (medio Guthrie, nuestro &quot;medio inicial&quot; véase la referencia 20). Lhx-1 ya no se expresa en las neuronas motoras, aunque hay alguna supervivencia de las células de LMC evidenciadas por FOXP1 expresión. D, V en (g) muestra la orientación de la dorsoventral (D, V), el eje de la médula espinal. ML muestra la orientación de la mediolateral (M, L) del eje de la sj cable pinal - l. Células LMCl (LHX-1 en el asta ventral en j) y la LMC en general (FOXP1 en k) pueden ser observados en rodajas cultivadas en medio que contiene 4% de suero de pollo y 100 ng / ml de CNTF. Tenga en cuenta que algunas células LMCl se encuentran en una posición lateral en el asta ventral. La flecha en (j) muestra la posición lateral de algunas de las células de los LMCl. (L) es una combinación de los dos canales m -. O. Estado de la expresión de LHX-1 (m) y FOXP1 (n) en las secciones de un embrión in ovo mantuvo durante el cultivo de cortes del embrión se muestra en la j - l. (O) es una combinación de los dos canales. P. La cuantificación del porcentaje de LMCl (FOXP1 + VE / Lhx1 + ve) en comparación con las células de LMC (FOXP1 + VE / Lhx1 ve-) células que se encuentran en cultivos de corte en diferentes condiciones compared para controlar embriones mantenidos in ovo (que representan 100%). La t de Student prueba representa *** p &lt;0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Cultivos de cortes de facilitar la manipulación del gen por el desarrollo del embrión y las perturbaciones farmacológicos. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que el desarrollo normal puede proceder en el entorno reducido de la rebanada. Se ilustra un protocolo que facilita el desarrollo normal de la médula espinal para continuar durante al menos 24 h.

Embriones de pollo de la Médula Espinal Slice Cultura Protocolo

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.9K vistas.  University College London. Cultivos de cortes de facilitar la manipulación del gen por el desarrollo del embrión y las perturbaciones farmacológicos. Sin embargo, las condiciones de cultivo deben garantizar que el desarrollo normal puede proceder en el entorno reducido de la rebanada. Se ilustra un protocolo que facilita el desarrollo normal de la médula espinal para continuar durante al menos 24 h.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique eliminates laminectomy by removing two spinous processes and lifting, then tilting the caudal vertebral arch. The surgical area opens up without the need for laminectomy. Lateral hemisection is then performed with direct visible control under a microscope. The trauma is minimized, requiring only a small bone wound. 
This technique has several advantages: it is faster and, therefore, less of a burden for the animal, and the bone wound is smaller. Because the laminectomy is eliminated, there is less chance for unwanted injury to the spinal cord, and there are no bone splinters that can cause problems (bone splinters embedded in the spinal cord can cause swelling and secondary damage). The vertebral canal remains intact. The main limitation is that the hemisection can only be performed in the intervertebral spaces. 
The results show that this technique can be performed much faster than the traditional surgical approach, using laminectomy (11 min vs. 35 min). This technique can be useful for researchers working with animal models of open spinal cord injury as it is widely adaptable and does not require any additional specialized instrumentation.

Here, we describe a new, fast technique modeling open spinal cord injury in rats that eliminates laminectomy. Lateral hemisection is performed while viewing through a microscope. The technique is versatile and can also be used in the cervical, thoracic, and lumbar regions of the spinal cord of other animals.

Una técnica de hemisección lateral de la médula espinal rápida y mínimamente invasiva para modelar lesiones abiertas de la médula espinal en ratas

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...