We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Reino Unido Casa Reglamento Oficina según se especifica en los Animales (Procedimientos Científicos) Ley (1986) en el marco del Proyecto de licencia número 60/4435. Para recoger los embriones en etapas específicas de desarrollo, apareamientos cronometrados se establecieron O / N. Mediodía en el día de la búsqueda de un tapón vaginal fue designado el día embrionario (E) 0.5. 1. La disección de la E7.5 o E8.5 postimplantación embriones para Ex Vivo Cultura <ol><li> Sacrificar los ratones hembras embarazadas por dislocación cervical. </li><li> Aislar el útero utilizando tijeras, sujetándolo con pinzas, y coloque en un plato de 30 mm lleno de medio M2. </li><li> Romper con cuidado, aparte del miometrio usando dos pares de pinzas finas. </li><li> Retire la decidua, teniendo cuidado de no perforar las cavidades extraembrionarias. </li><li> Retire la membrana de Reichert pellizcando con fórceps y lentamente que lo separa del embrión. </li><li> Compruebe los embriones bajo una disecciónestereomicroscopio para asegurar que el saco vitelino, amnios y el cono ectoplacental están intactos. </li><li> La transferencia de los embriones a un plato limpio de M2 ​​utilizando una pipeta y el lugar en un 30 mm placa de Petri de plástico tapa sobre hielo (la &quot;plataforma de hielo &#39;) a embriones parcialmente frialdad. </li><li> Si es necesario, almacenar embriones en M2 en una plataforma de hielo de hasta 1,5 horas, por ejemplo., Durante la preparación de los medios de comunicación o la manipulación de pequeños lotes de ~ 3-4 embriones a temperatura ambiente. Nota: Recuperación y disección de embriones de roedores ha sido descrito en detalle previamente 7,8,16. </li></ol> 2. Preparar el medio de cultivo de embriones <ol><li> Recién descongelar o bien suero de rata comercialmente disponible (ver Glanville-Jones et al. 13 para las especificaciones), o suero de rata preparado en la casa de acuerdo con Copp y Cockroft 16 que fue inactivado por calor durante 30 min a 56 ° C y se congela en 1 ml alícuotas a -80 ° C Nota: suero de rata comercialmente disponible es aceptable<html> por períodos de cultivo de 24 a 36 horas, aunque el suero preparado en casa es, en nuestra experiencia, superior para periodos de cultivo de hasta 48 horas. </li><li> Recién preparar un exceso (por ejemplo., 10 ml) de suplementos definidos que consisten en Medio Esencial Mínimo de Glasgow (GMEM), aminoácidos 1% no esenciales (NEAA), 2 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM. </li><li> Calcula el volumen de medio de cultivo que se necesita de acuerdo con el número de embriones de cada etapa que van a ser cultivadas (véase la sección 3). Mezclar el suero de rata con los suplementos definidos para compensar medio de cultivo 50% (1: 1 (v / v) de suero de rata: suplementos definidos) y / o medio de cultivo 75% (3: 1 (v / v) de suero de rata: se define suplementos). </li><li> Pasar el medio de cultivo de embriones a través de un filtro de 0,45 micras y añadir 10 000 IU / ml de penicilina y 10 mg / ml de estreptomicina. Nota: La solución de L-glutamina y piruvato de sodio recién descongelado es crucial para el desarrollo del embrión durante el cultivo ex vivo. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Ex Vivo Cultura Condiciones para distintas etapas embrionarias <ol><li> Para los embriones E7.5: cultivo estático utilizando placas de 4 pocillos en una incubadora se suministra con 5% de CO 2 en el aire a 37 ° C durante 24 horas. Cultura hasta dos embriones por pocillo en medio de cultivo 1 ml de 50%. </li><li> Para embriones E8.5: utilizar un aparato de cultivo de rodillo 8 que gira a 35 revoluciones / min incorporación de gaseado continuo con 5% de CO 2 en el aire a 37 ° C durante 24 hr (1 ml de 50% de medio de cultivo por embrión). </li><li> Para los embriones E9.5: utilizar un aparato de cultivo de rodillo que gira a 35 revoluciones / min incorporación de los gases suministrados con 5% de CO 2, 40% O 2 55% 2 N a 37ºC durante 24 hr (1 ml de 75% de medio de cultivo por embrión). Nota: embriones Cultura dentro de 3 horas después de la eutanasia de los ratones como períodos prolongados en M2 afectar negativamente el desarrollo. Ver Copp y Cockroft 16 para el método de cultivo de embriones ex vivo. </li></ol> 4. Grafting Las células cultivadas en E7.5 o E8.5 embriones de ratón <ol><li> Físicamente raspar EpiSCs, que expresan de forma ubicua GFP, de una placa de cultivo de 6 pocillos utilizando una punta de pipeta 20-200 l y colocarlos en un plato de 30 mm que contiene los embriones Nota: Para insertar grupos de células en los embriones, las células deben ser desechados físicamente en lugar de con tripsina. </li><li> Adjuntar un capilar injerto tirada a mano con el tubo aspirador para hacer una pipeta de boca. </li><li> Chupar suavemente la pipeta de boca para extraer uno o más grupos de células de tamaño&gt; 20 células en el capilar injerto. </li><li> Soplar suavemente las células, para dispersar parcialmente los grupos grandes. </li><li> Seleccione una celda que contiene grupo ~ 10-20 células y chupar en el capilar injerto de nuevo, manteniéndola cerca de la abertura del capilar. Tenga cuidado de no mover el grupo de células dentro y fuera de los capilares en repetidas ocasiones, para evitar la ruptura en pedazos más pequeños. </li><li> Mantenga el embrión sin apretar en su lugar con un par de pinzas e inserte el injertocapilar en la región de interés para crear una abertura. </li><li> Expulsar suavemente el grupo fuera del injerto capilar, dejando la cadena corta de 10-20 células presentadas en el embrión. </li><li> Repetir el procedimiento de injerto para el número deseado de embriones. Utilice tamaños de lote de 3-4 embriones para mayor comodidad. </li><li> Dejando de embriones en el mismo plato de medio M2, la imagen de los embriones injertadas utilizando un compuesto de fluorescencia microscopio de disección con la cámara, manteniendo el tiempo de formación de imágenes a un mínimo para evitar la exposición de los embriones a la luz excesiva y el calor. Nota: determinar los tiempos de formación de imágenes empíricamente ya que estos dependerán de las especificaciones de la cámara y el microscopio, así como la intensidad y la naturaleza de la fluorescencia del fluoróforo. </li><li> Transferencia del embrión en un pastette con un volumen mínimo de medio M2 a preequilibrado medio de cultivo (véase la sección 3) inmediatamente después de la impresión. Nota: Examine cuidadosamente la morfología de los embriones después del injerto. Sólo la cultura del INTACt embriones. </li></ol> 5. Hecho a mano electroporación Materiales y configuración Aparato (preparar los siguientes en Anticipación de experimentos de electroporación): <ol><li> Para pipetas de inyección de ADN: tire pipetas de inyección de ADN utilizando un extractor de micropipeta horizontal. Pipetas de inyección deben tener una punta fina con una abertura de menos de 10 micras para evitar daños en los tejidos al inyectar ADN en las cavidades embrionarias. </li><li> Para el vidrio capilar electroporación: utilizar un microforge para cortar la apertura de las pipetas de inyección de ADN para un diámetro interno de ya sea 20 o 30 micras. Para evitar el daño celular cuando el capilar está en contacto con el embrión para la electroporación, la punta del capilar de vidrio se debe cortar de manera limpia y no contiene, bordes rotos afilados. </li><li> Para un electrodo capilar hecho a mano (ánodo) (Figura 1): insertar un diámetro de alambre de platino 0,2 mm en un capilar de vidrio de electroporación con una abertura fija de 20 o 30 m de diámetro para enfocar los elegidosric actual y entregar el ADN del plásmido a una pequeña región de interés en el embrión. </li><li> Para un electrodo en forma de L hecha a mano (cátodo) (Figura 1): doblar un alambre de platino de diámetro 0,2 mm creando una forma de &quot;L&quot;, con la parte horizontal de la &quot;L&quot; alrededor de 1 mm de longitud. </li><li> Conecte cada electrodo de platino a un cable delgado y aislado y la inserta en un soporte de aguja de microinyección cubierta por cinta aislante. </li><li> Montar los soportes de agujas en los titulares de instrumentos micromanipulación estándar. </li><li> Conectar el circuito como se muestra en la Figura 1: conecte el electrodo capilar para el ánodo de la fuente de alimentación; conectar el electrodo en forma de L al ánodo del multímetro; conectar el cátodo de la mulimeter al cátodo de la fuente de alimentación. </li></ol> 6. La electroporación E7.5 o E8.5 embriones de ratón <ol><li> Llene el capilar de vidrio electroporación con PBS para dentro de 1-2 mm de la parte superior e inserte el straielectrodo de platino lucha (ánodo) en el capilar de vidrio hasta que alcanza la parte inferior del capilar. </li><li> Ancla el electrodo en forma de L (cátodo) en la superficie de una placa de Petri 30 mm lleno de PBS. </li><li> Transferir el embrión a partir de medio M2 en el plato electroporación lleno de PBS. </li><li> Insertar la aguja de inyección de epiblasto lateral en la cavidad amniótica del embrión. El uso de una bomba de pico neumático, inyectar solución de ADN (pCAG-Cre: GFP o pCAG-GFP 1-1.5 mg / ml con 0,01% de colorante colorante verde) en la cavidad hasta que esté completamente lleno. Para los embriones E7.5-E8.5, se requiere solución de ADN de menos de 5 l durante un embrión. Utilizando el tinte verde como indicador, tenga cuidado de no reventar el embrión. </li><li> Posicionar cuidadosamente el embrión entre los electrodos y mover el electrodo capilar a la ubicación precisa donde el ADN se va a entregar. Nota: La orientación del embrión depende de la región en la que el ADN es para ponerse a electroporación. </li><li> Electropocalificar el embrión utilizando 200 voltios (V) en 6 pulsos, cada uno de 50 ms de duración, con un intervalo de 1 segundo entre cada pulso. </li><li> Transferir el embrión pre-equilibrada medio de cultivo inmediatamente después de la electroporación. Si lo desea, repita el proceso para la siguiente embrión. Nota: Añadir el medio de cultivo en un recipiente estéril y lo puso en la incubadora de cultivo de comprobar la validez de equilibrar el medio. </li><li> Para detectar las células electroporadas 2 horas después de la cultura, la transferencia de los embriones a una limpia de 30 mm placa de Petri de medio M2 utilizando un pastette. Imagen de los embriones como en el paso 5.9 utilizando un compuesto de fluorescencia microscopio de disección. </li><li> La transferencia de los embriones de nuevo a la cultura mediante un pastette inmediatamente después de la impresión. </li><li> Para detectar las células muertas causadas por electroporación, manchar los embriones con una célula de colorante rojo lejano impermeable a la membrana nuclear (1: 200 en medio de cultivo de embriones) a 37ºC durante 10 min 2 h después de la electroporación (Opcional) </li><li> Para contar las células electroporadas, fijar el embryos en el 4% de paraformaldehído (PFA) durante 2-4 horas a 4 ° C, mancha el núcleo con una luz ultravioleta o rojo lejano contratinción nuclear fluorescente y la imagen de los embriones utilizando un microscopio confocal (Opcional). Nota: el crecimiento embrionario se ve afectada negativamente si se deja demasiado tiempo en PBS. Por lo tanto, asegúrese de que el tiempo necesario para electroporar cada embrión se reduce al mínimo (&lt;5 min por embrión). </li></ol>

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The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Injerto El paso crítico para los experimentos de injerto celular es la inserción de una cadena coherente de células idealmente en una sola acción, para evitar la ruptura de la mata. Esta técnica requiere un poco de práctica en el control de la pipeta de boca. Si las células donantes incorporan bien en el huésped, sus derivados se dispersarán en el embrión. A fin de determinar si las células derivadas de donantes dispersado diferencian apropiadamente en el huésped, la inmunotinción se puede realizar en las secciones de embriones. Si las células del donante no son compatibles con el entorno de acogida, que o bien no pueden ser detectados (a medida que son expulsados ​​del embrión) o formar montones no incorporadas en los embriones después del cultivo. Si se observaron tanto en células dispersas y grupos de células, esto puede indicar que demasiadas células fueron injertados y células del donante excesivas que no pueden interactuar con las células huésped que rodean dado lugar a la formación de grupo. En este caso, los injertos adicionales que contienenun menor número de células se puede realizar. La principal limitación de la técnica de injerto de células es que no es posible determinar el potencial in vivo de células de ratón desde el cultivo ex vivo durante períodos de más de 48 hr no se ha logrado. Sin embargo, si se combina con la inyección de células guiada por ultrasonido, puede ser posible transferir las células cultivadas a los embriones en el útero. En resumen, los experimentos de células injerto se han utilizado ampliamente en nuestro grupo y nos han dado pistas valiosas sobre el potencial in vivo de diversos tipos de células 4,21,22. Es una técnica de utilidad general para evaluar el potencial in vivo de las células cultivadas in vitro en los embriones tempranos postimplante. La electroporación Aunque en este estudio sólo hemos demostrado que es eficaz utilizar la técnica de electroporación capilar para dirigir el epiblasto, it También es posible dirigir intencionalmente otras capas germinales, tales como células del endodermo. El paso crítico para la técnica de electroporación capilar es reducir al mínimo el tiempo necesario para electroporar cada embrión (&lt;5 min por embrión), ya que es muy PBS subóptima para los embriones tempranos de ratón. Nuestros datos anterior ha demostrado que, en la mayoría de las áreas en los embriones, electroporación no afecta el crecimiento de embriones. Sin embargo, la electroporación en el nodo causada desarrollo anormal y llevó a la muerte prematura del embrión. Esto es probablemente debido a los daños o la muerte de las células que forman los centros de señalización importantes 23. Por lo tanto, esta región tendría que ser evitado con esta técnica. Una advertencia adicional es que, como se menciona en la sección de resultados, mientras que epiblasto o células racha primitivos fueron atacados, fueron también electroporaron algunas células del endodermo. Esto puede ser porque el ADN llega hasta el endodermo a través de huecos en el marco del epitelio epiblasto. Endodermo se compone de células epiteliales y en nuestra experiencia ºcélulas ESE tienen una mayor propensión a asumir ADN. Por lo tanto, al aplicar esta técnica para el mapeo de destino, es importante evaluar el cual las células inicialmente tome ADN. También hay que señalar que, aunque pCAG-GFP y pCAG-Cre: plásmidos GFP pueden ser entregados de manera eficiente utilizando los parámetros de electroporación que se muestran en este estudio, la eficiencia de otras construcciones de ADN puede variar y deben optimización individual. Las alteraciones en la concentración de ADN, el voltaje de electroporación o el número de impulsos se pueden hacer si se encuentran plásmidos a ser difíciles de transfectar. En resumen, nuestro sistema de electroporación capilar optimizado de manera eficiente y reproducible puede entregar GFP o Cre: plásmidos GFP en muy pocas células en el embrión con la muerte celular limitado. Dado que este método no requiere equipo costoso o altamente especializado, puede ser de gran utilidad para los estudios de rastreo celular o en probar el efecto de la expresión ectópica o condicional o deleciónf genes en embriones tempranos, si la electroporación se lleva a cabo en embriones portadores de alelos mutantes condicionales floxed. Por lo tanto, esta técnica de electroporación proporciona una herramienta útil para la comprensión funcional en una base de celda por celda las funciones de los factores de células intrínseca en el contexto de entornos embrionarias de tipo salvaje localizada.

Cultivo celular ha sido ampliamente utilizado en los estudios de biología del desarrollo. Las células madre embrionarias de ratón (CES) y células madre epiblasto (EpiSCs) se diferencian en las tres capas germinales in vitro y son un modelo útil para la diferenciación celular a principios de la embriogénesis de los mamíferos. La derivación de estas líneas celulares se ha abierto una oportunidad para la manipulación in vitro y la investigación detallada de los eventos de señalización localizada y redes transcripcionales que operan durante principios de desarrollo embrionario. Sin embargo, sigue siendo importante para determinar la relevancia in vivo de las manipulaciones realizadas en la cultura. El potencial in vivo de preimplantación ratón CES derivadas de embriones se ha evaluado mediante la introducción de nuevo en embriones de preimplantación (mórulas o blastocistos) 1. Sin embargo, EpiSCs que representan las células del epiblasto en embriones postimplante no pueden integrar de manera eficiente en los embriones de preimplantación 2,3. Nuestra Previonos hallazgos han demostrado que EpiSCs puede generar eficientemente quimeras y contribuir a todas las capas germinales, cuando injertado en embriones postimplante 4. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar las células cultivadas in vitro es de darles a conocer su correspondiente entorno in vivo. La electroporación es un método ampliamente utilizado para entregar moléculas exógenas en células específicas en tanto in vivo e in vitro experimentos. La energía eléctrica puede generar un gran número de poros en la membrana celular, que permite que el ácido exógeno desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) para entrar en las células. Uno de los mayores retos para esta técnica es combinar la viabilidad celular óptimo con alta electrotransfección 5,6 eficiencia. Para la electroporación de ácidos nucleicos en tejidos embrionarios, chapado en oro electrodos han sido más comúnmente utilizado, lo que permite la orientación de las células en una amplia gama espacial 7-9. Para lograr una más locala transferencia de genes lized, un electrodo en forma de aguja se ha utilizado para lograr un campo eléctrico focal 10,11. Utilizando este método, los autores mostraron que después de la electroporación, alrededor de 30 a 60 células habían tomado la construcción de ADN 11. Sin embargo, parece que el ajuste de precisión el número de células electroporadas sigue siendo difícil con un electrodo de ancho fijo. La técnica de electroporación capilar ha sido utilizado para entregar los plásmidos a las células individuales 12-14. Sin embargo, esta técnica no se ha aplicado para la electroporación de plásmidos a los embriones ex vivo. Más recientemente, un microdispositivo se ha informado que localmente electroporar unas pocas células del endodermo visceral distales (menos de 4 células) en embriones de ratón postimplante temprana 15. Sin embargo, todavía no se sabe si este dispositivo se puede orientar de manera eficiente ectodermo y mesodermo ex vivo. En este estudio se describen dos métodos novedosos para evaluar la función celular y el gen en el post temprana-implantation embriones. En primer lugar, demostramos cómo injertar células cultivadas in vitro en los sitios definidos en embriones tempranos de ratón para evaluar su potencial en vivo. La integración de las células injertadas y sus descendientes, todos etiquetados por un marcador genético (por ejemplo, una proteína fluorescente verde (GFP), puede ser examinada de nuevo por inmunotinción de proteínas específicas de tejido 4. En segundo lugar, se describe un método mejorado para ofrecer precisamente ADN a sitios localizados en el embrión por medio de electroporación. En lugar de utilizar un electrodo en forma de aguja, insertamos un alambre fino dentro de un capilar de vidrio de punta fina, y demostramos que esta modificación puede administrar ADN a un pequeño número de células con alta eficiencia y limitada celda de la muerte. Por otra parte, nos muestran que mediante el uso de capilares de vidrio con diferentes tamaños de apertura, se puede controlar el número de células electroporadas. Por lo tanto, creemos que este método puede ser de gran utilidad para estudiar el desarrollo embrionario temprano que involucra pequeñas cantidades océlulas f.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Forceps</td>
			<td style="width:275px;">Dumostar</td>
			<td style="width:275px;">T5390</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Dissecting stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">&#160;Zeiss</td>
			<td style="width:275px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Stereomicroscope system with fluorescence&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Nikon</td>
			<td style="width:275px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted microscope with a digital camera</td>
			<td style="width:275px;">Olympus</td>
			<td style="width:275px;">Olympus BX61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:275px;">Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">11397863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">30mm Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4-well plates</td>
			<td style="width:275px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:275px;">179820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">10010015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">NICHIRYO</td>
			<td style="width:275px;">Nichipet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:275px;">685280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">SANYO</td>
			<td style="width:275px;">MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Roller culture apparatus&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTC Engineering</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Syringe filters 0.45&#181;m, sterile&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">10462100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30549.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:275px;">DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN&#160;</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:347px;">Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:275px;">640798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">A5177-5EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:275px;">P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">De Fonbrune</td>
			<td style="width:275px;">BS030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pneumatic pico pump&#160;</td>
			<td style="width:275px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:275px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microloader tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:275px;">5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ECM 830 square wave pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTX</td>
			<td style="width:275px;">45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Green food coloring dye</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">C.I. 42053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td>
			<td style="width:275px;">Biotium</td>
			<td style="width:275px;">40060-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-Cre:GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#13776&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Multimeter</td>
			<td style="width:275px;">Excel</td>
			<td style="width:275px;">XL830L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Micromanipulators&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leitz&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">0.2mm diameter platinum wire&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:275px;">E404-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:275px;">Abcam</td>
			<td style="width:275px;">ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Goat anti-Chicken IgY, HRP</td>
			<td style="width:275px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:275px;">sc-2428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Dako</td>
			<td style="width:275px;">K3467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red fluorescence nuclear counterstain</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

La manipulación y la cultura de embriones tempranos de ratón es un potente y gran parte subutilizado tecnología de aumentar el valor de este modelo de sistema. Por el contrario, el cultivo de células ha sido ampliamente utilizado en los estudios de biología del desarrollo. Sin embargo, es importante para determinar si las células cultivadas in vitro realmente representan en tipos de células in vivo. El injerto de células en embriones, seguido por una evaluación de su contribución durante el desarrollo es un método útil para determinar el potencial de las células cultivadas in vitro. En este estudio, se describe un método para injertar células en un sitio definido de embriones de ratón postimplante temprana, seguido de cultivo ex vivo. También presentamos un método de electroporación optimizado que utiliza capilares de vidrio de diámetro conocido, lo que permite la localización precisa y el ajuste del número de células que reciben ADN exógeno tanto con alta eficiencia de transfección y la muerte celular bajo. Estas técnicas, que no requieren ninguna spequipos ecialized, render manipulaciones experimentales de la gastrulación y organogénesis embrión de ratón de la fase temprana posible, permitiendo el análisis del compromiso en las subpoblaciones de células cultivadas y el efecto de las manipulaciones genéticas in situ sobre la diferenciación celular.

Injerto EpiSCs que expresan de forma ubicua EGFP (r04-GFP, derivado de E6.5 epiblasto, y C2, derivado in vitro a partir mESCs) 4 se rasparon manualmente desde la placa de cultivo y injertados en diferentes sitios de embriones E7.5 (Figura 2a). Los embriones se cultivaron ex vivo y se analizaron después de 24 hr. La distribución de las células del donante se evaluó por microscopía de fluorescencia. Si las células del donante incorporados, que proliferaron y sus derivados dispersan dentro de los embriones de acogida (Figura 2B). Se ha observado que los injertos de células que contienen 10-16 incorporados de manera eficiente en los embriones de acogida (Figura 2A, y 2B), sin embargo, el injerto más células no da lugar a una mejor quimerismo. En cambio, las células injertadas producen grumos no incorporadas (Figura 2C y 2D). La electroporación Para unaE valuar la eficiencia de nuestro sistema de electroporación, se entregó plásmidos que expresan GFP (pCAG-GFP y pCAG-Cre: GFP) a sitios específicos en el embrión. De acuerdo con un estudio previo 11, se detectaron células GFP + en embriones de 1-2 horas después de la electroporación (Figura 2E y 2G). Cuando se electroporated células epiblasto distales a finales del primitivo embrión etapa consecutivas, células marcadas contribuyeron al ectodermo neural después de 24 horas en cultivo (Figura 2E y 2F). Este resultado se corresponde bien con mapas destino conocidas de células epiblasto en gastrulación embriones en etapa 17. Del mismo modo, cuando el plásmido de expresión de GFP se sometió a electroporación en la línea primitiva en E8.5 (2-5 somitas), las células GFP + contribuyeron a la mesodermo paraxial (Figura 2G y 2H), consistente con mapas destino conocidas de la línea primitiva finales 18 . Por otra parte, se observó contribución a las tres capas germinales de células electroporadas (Figura 2I-K),lo que sugiere que el procedimiento de electroporación no compromete el comportamiento celular in vivo. Sin embargo, también nos dimos cuenta de que, si bien epiblasto (E7.5) o células racha primitivos (E8.5) fueron atacados, algunas células del endodermo también se sometieron a electroporación (Figura 3C y Tabla 1). Una de las principales ventajas de utilizar un electrodo capilar es que el número de células electroporadas se puede controlar, simplemente cambiando el diámetro de su abertura. Para determinar el número de células electroporadas, los embriones se fijaron 2 hr después de la electroporación y la imagen en wholemount en un microscopio confocal. El número de células GFP + se contó manualmente en los confocal z-pilas. Tabla 1 muestra que, para una etapa dada, aumentando el tamaño de apertura de la capilar de vidrio de 20 a 30 micras resultados en la captación de ADN por más células. Cuando un solo tamaño de la abertura se comparó entre las etapas (E7.5 frente E8.5), se encontraron más células a electroporación en la última etapa. Este efecto puede ser debido a una mayor concentración de ADN presente en la cavidad amniótica en E8.5. Debido a que la solución de ADN se mezcló con el tinte verde de alimentos, podemos utilizar el color verde para evaluar la concentración de ADN en la cavidad amniótica. En el microscopio, es evidente que, en comparación con los embriones E8.5, el color verde después de la inyección de ADN es mucho más ligero en la cavidad de los embriones E7.5. Aunque la misma concentración de solución de ADN se inyecta en E7.5 y E8.5 embriones, más solución de ADN estaba en la cavidad amniótica de embriones E8.5 con el fin de llenar por completo porque son más grandes en el tamaño. Después de retirar la aguja de inyección, siempre hay algún grado de fuga de solución de ADN de la cavidad amniótica, y puesto que el orificio de punción es más grande en comparación con el tamaño de la cavidad amniótica en embriones anteriores, es probable que no hubo proporcionalmente más fugas a partir de embriones E8.5 E7.5 que, llevando a una concentración de ADN inferior. El número diferente de transfectadaslas células también podría ser debido a los diferentes diámetros o voltaje transmembrana inducida (ITV) los umbrales de células en diferentes etapas. Un inconveniente de la electroporación es la muerte celular asociada. Similar a la chapado de oro tradicional o electrodos en forma de aguja, electroporación utilizando un electrodo capilar también causa la muerte celular. Después de la electroporación la región objetivo apareció de color más oscuro en comparación con las regiones vecinas (Figura 3A y 3B), lo que indica que un cierto grado de muerte celular debe haber ocurrido en esta área. A fin de determinar el número de células muertas causadas por el procedimiento de electroporación, los embriones se tiñeron con una célula de colorante nuclear fluorescente a la membrana impermeable. Los núcleos de las células muertas fueron marcadas con un colorante de fluorescencia roja lejana-membrana impermeable. La tinción confirmó que esta técnica de electroporación capilar solamente resulta en un pequeño número de células muertas cerca del sitio de electroporación (Figura 3D y Table 1). Nos dimos cuenta de que, aunque las células muertas aparecen en el sitio de la electroporación, las células GFP + y las células muertas son también más exclusivo entre sí (Figura 3E y 3F). Por otra parte, cuando el epiblasto lateral caudal en E8.5 se sometió a electroporación con pCAG-GFP y una abertura capilar de vidrio de 20μm, un gran número de células GFP + se detectó después de 48 h en cultivo (Figura 3G y 3H). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren mayoría de las células GFP + detectaron 2 hr después de la electroporación siguen siendo viables durante el cultivo adicional. Marcamos el número de células GFP + después de 24 horas ex vivo cultura. Seis embriones fueron electroporación con pCAG-GFP en E7.5, utilizando una abertura capilar de diámetro 20μm. 107 ± 31 (media ± DE) se detectaron GFP + células / embrión. Dado que en el inicio de la cultura (2 hr), 9 células se sometieron a electroporación en promedio por embrión ( <s<html> trong&gt; Tabla 1), lo que sugiere que las células se sometieron a electroporación 3-4 divisiones dentro de 2 horas. El medio de celda tiempo de duplicación de embriones E8.5 E7.5 a es de 6-7 hr en todas las células aparte de los en el nodo ventral 19,20. Esto sugiere que el procedimiento de electroporación no obstaculice el crecimiento celular normal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de circuito que muestra la configuración de la electroporación. La solución de ADN del embrión que contiene en su cavidad amniótica se posicionó entre los dos electrodos. Actual en los parámetros elegidos fue proporcionada por un generador de impulsos de onda cuadrada (fuente de alimentación). Un multímetro se conecta en serie para detectar la corriente eléctrica que pasa el embrión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Figura 2. La distribución de las células injertadas o electroporadas en embriones de acogida. (AH) superposiciones de fluorescencia de GFP (verde) en las imágenes de campo claro de embriones wholemount (escala de grises) (A) 10-16 GFP + EpiSCs fueron injertados en la región distal de un tarde embrión -streak etapa. (C) Un grupo grande de las buenas prácticas agrarias + EpiSCs se injerta en la región distal de un embrión etapa de mediados de racha. (B y D) La distribución de EpiSCs células derivadas (verde) en los embriones de acogida (se muestra en la A y C) después de 24 h en cultivo. () células GFP + B dispersas en el embrión de acogida, lo que sugiere correcta integración de las células del donante. (D) El injerto de grandes grupos de células resultaron en la formación de grupo no incorporada en el embrión de acogida. (EK) pCAG-Cre: plásmido GFP ele<html> ctroporated en áreas específicas de los embriones de tipo salvaje. Electroporación de la región distal de un embrión brote temprano etapa (E) o la primitiva racha de 2-5 somite etapa embrionaria (G) dio lugar a células GFP + en estas regiones 2 hr después del procedimiento. (F y H) La distribución de las células GFP + en los embriones de acogida después de 24 horas en la cultura, lo que demuestra que las células electroporadas contribuyen a la neuroectodermo (flecha negro) (F) y el mesodermo paraxial (flecha blanca) (H). (IK) DAB inmunotinción para las células GFP + que muestran que las células electroporadas pueden dar lugar a la neuroectodermo (I), mesodermo (J) y el endodermo (J y K) después de 24 h en cultivo. Barra de escala (AH) = 250 m; barra de escala (IK) = 100 micras. Nota: La figura 1A y 1B se reimprimen de nuestra publicación anterior 4.href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> Figura 3. Distribución de GFP + células y las células muertas en los embriones después de la electroporación (AC) pCAG-Cre:. Plásmido GFP a electroporación en las células epiblasto laterales caudales de una E8.5 (2-5 somite etapa) embrión (tamaño de la abertura capilar :. 20 micras) (A) 2 hr después del procedimiento, la región diana mostró un color oscuro (flecha blanca) en comparación con otras partes del embrión. El recuadro muestra una ampliación de la región a electroporación. (B) Imagen Brightfield (escala de grises) superpone con el canal verde fluorescente que muestra las células electroporadas (verde). (C) Un confocal z-slice mostrando quedos células del endodermo (verde) también tomaron el plásmido cuando fueron blanco de las células del epiblasto laterales caudales. Los núcleos celulares se muestran en rojo (DF) pCAG-Cre:. Plásmido GFP se sometió a electroporación en el aspecto caudal del nodo de un embrión E8.5 (capilar tamaño de abertura: 30 micras). El embrión se cultivó durante 2 hr. Las células electroporadas se muestran en las células verdes y muertos en rojo. (D) El área de electroporación contiene tanto células GFP +, así como células muertas. El área en el cuadro blanco se analizaron en un microscopio confocal. Conteo manual de la z-stack mostró que había 33 GFP + células y 23 células muertas en esta área. Sólo dos células fueron positivas para ambos fluoróforos. (E y F) Vista XYZ de un confocal z-rebanada de la región en caja blanca en D mostrando células GFP + son independientes de las células muertas. Los núcleos se muestran en azul (G y H) pCAG-Cre:. Plásmido GFP se electroporación en algunos cells en el epiblasto lateral caudal de un embrión E8.5 (capilar tamaño de apertura: 20 micras) y fotografiado después de dos (G) y 48 (H) horas ex vivo la cultura Nota: (H) El embrión se cortó en dos después de la cultura. Se eliminaron los regiones de la cabeza y del corazón. Barra de escala (A, B, D, G y H) = 250 m; barra de escala (C, E y F) = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Diámetro de la abertura del tubo capilar </td><td> Etapa de embriones </td><td> Eficiencia electroporación: no. embriones que contienen GFP + células después de 2h / nº total. embriones de electroporación (no. GFP + embriones que se desarrollaron normalmente después de 24 o de la cultura 48h) </td><td> Número medio de las buenas prácticas agrarias + células por embrión ± SD (n = no. De embriones examinados) </td><td> No. deGFP + endodérmicas células por cada embrión ± SD (n = no. De embriones examinados) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E8.5 (2-5 somitas) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E8.5 (2-5 somitas) </td><td> 2/2 (2) </td><td> 33 y 26 (n = 2) </td><td> 14 y 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Eficiencia Electroporación de pCAG-Cre: plásmido de GFP en embriones de ratón. Abreviatura: LS, etapa línea primitiva tarde; LB: etapa de brotación tardía. Los embriones se organizaron de acuerdo aDowns y Davies 12

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K vistas.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma de perfiles de<em&gt; In-Vivo</em&gt; Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...