Esta investigación fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud, subvención R01 EB007594, el Departamento de Programa de Defensa de Breast Cancer Research, la propuesta BCO74699P7, y la Fundación Susan G. Komen conceder 26152/98188972.

1. Microendoscope Asamblea El microendoscope de alta resolución se describe aquí (figura 1) debe ser considerado como una configuración de base con algunas variaciones posibles en el montaje y aplicación. Se describe en detalle la encarnación de la plataforma que está diseñada para ser utilizada con proflavina como un agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear es una brillante mancha con pico de absorción y emisión de longitudes de onda de 445 nm y 515 nm, respectivamente. El uso de otros agentes de contraste se requiere que el usuario seleccione la excitación, emisión y filtros dicroicos adecuadamente. Varios elementos de la microendoscope de alta resolución son de carácter genérico y se puede obtener de múltiples proveedores. Por ejemplo, los componentes óptico-mecánica de posicionamiento están disponibles en Thorlabs, Newport, Linos, entre otros. Compactas cámaras CCD están disponibles de compañías como Point Grey Research, Prosilica y Retiga; sensibilidad de la cámara deben ser elegidos de acuerdo a la luminosidad del fluoróforo que se utilizarán, así como el tipo de marco. De alta potencia de los diodos emisores de luz (LED) se puede obtener de Luxeon, cree, y Nichia, entre otros. De fibra óptica de paquetes están disponibles a partir de Sumitomo, Fujikura, y Schott. En la selección de componentes para una aplicación específica, el usuario debe considerar las relaciones inherentes a la microscopía de fluorescencia entre la concentración del fluoróforo, photobleaching, intensidad de la iluminación, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición. <ol><li> Conecte el 6 &quot;barras de la jaula a los 1,5&quot; barras de la jaula, para formar un par de 7.5 &quot;varas de largo. Tornillo de estas barras en una sola cara de la unidad de espejo doble. Tornillo de 0,5&quot; barras en la cara opuesta. Deslice el cubo de la jaula en las barras de la jaula, a través de la parte inferior dos orificios pasantes. Tornillo de 2 &quot;barras en la cara lateral del cubo de la jaula (fig. 1B). </li><li> Conecte la cámara a una placa de la jaula con un C-mount a un adaptador de SM1. Fije la placa de la jaula en el 0,5 barras de la jaula &quot;, alineado con la cara de la unidad de espejo doble. </li><li> Inserte el &quot;tubo&quot; de la lente en un 3 &quot;tubo de la lente de largo y asegurar el objetivo con un anillo de retención. La longitud focal de la lente debe ser seleccionado de tal manera que los núcleos del haz de fibra óptica se muestra por lo menos dos píxeles cuando se proyecta en la cámara. Coloque el filtro de emisiones en el tubo en la parte superior del primer anillo de contención, y añadir otro anillo para bloquear el filtro en su lugar. Tenga en cuenta las convenciones orientación filtro indicado por el fabricante del filtro. Atornille el tubo de la lente en el lado de la jaula de cubo más cercano a la cámara CCD. Tenga en cuenta que en la figura 1c, este objetivo y el filtro se muestran sin el tubo de la lente 3 &quot;para mayor claridad. </li><li> Conecte la cámara a un ordenador y ver la imagen en la pantalla. Dirigir el montaje de la jaula en un objeto distante y deslice el cubo de la jaula a lo largo de los rieles hasta que aparece una imagen en foco. Bloquear el cubo de la jaula en este lugar. (Este es un método sencillo de asegurar que el lente del tubo se forma una imagen nítida cuando se combina con el infinito lente con corrección de objetivos). </li><li> Inserte el espejo dicroico en el soporte y el lugar 45 º en el cubo de la jaula. </li><li> Tornillo de la lente del objetivo, a través de un adaptador de rosca RMS a SM1 y un tubo de lente ajustable, en la cara del cubo de la jaula frente a la titular de la lente del tubo. Un z-traductor puede ser utilizado en lugar del tubo de lente ajustable para facilitar el enfoque. Tornillo de un conector SMA en una placa de montaje de la jaula y esta en las barras, aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente del objetivo. </li><li> Montar un LED en una placa de la jaula y deslizarse hacia el extremo de los dos &quot;varas. Añadir una lente a un 0,5&quot; tubo de la lente de tal manera que cuando este tubo se atornilla en el lado del cubo jaula, se forma una imagen del LED que llena la abertura posterior de la lente del objetivo. Esta configuración (Kohler iluminación) se asegurará de que la cara proximal del haz de fibra óptica es uniformemente iluminada. Añadir el filtro de excitación en el tubo de la lente de 0.5 &quot;y seguro en su lugar con un anillo de retención (figura 1c). </li><li> Conecte un conector SMA a un paquete de fibra óptica. Atornille el conjunto SMA conectorizado en el receptáculo de SMA montados en las barras de la jaula. Dirigir el extremo distal del haz hacia una fuente de luz de banda ancha (iluminación fluorescente es suficiente) y observe la imagen de la cara proximal paquete de la cámara CCD. Ajustar la posición de la lente del objetivo por atornillado dentro o fuera del cubo de la jaula hasta que la imagen aparece un haz de fibras en el enfoque. Los núcleos individuales deben ser claramente visibles (Figura 2). </li></ol> 2. GRIN conjunto de la lente La resolución espacial de la microendoscope se puede aumentar por colocar un objetivo de micro-o conjunto de la lente en la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas están configurados de tal manera que en lugar de colocar la punta del paquete directamente en el tejido, la punta se forma la imagen sobre la superficie del tejido con demagnification, lo que aumenta la frecuencia de muestreo espacial impuesta por la orientación de luzING núcleos del haz de fibras. El grado de demagnification corresponde al aumento de la resolución espacial, y al mismo tiempo, a una disminución proporcional en el campo de visión. Componentes del gradiente de índice (GRIN) son compatibles con lentes de fibra óptica y están disponibles en GrinTech, GSN, Schott, entre otros, y puede ser directamente unido a la punta distal de un haz de fibras. <ol><li> Seleccione una lente GRIN con la ampliación deseada y la distancia de trabajo para su aplicación. Asegúrese de que el diámetro de la lente superior a la del haz de fibras va a trabajar. Recomendamos que el haz de fibras y el cristalino GRIN ser montado en distintos estadios de 3 ejes de posicionamiento manual bajo el microscopio estereoscópico de baja potencia o de una correcta alineación antes de la unión. </li><li> Coloque una gota de pegamento óptico (por ejemplo, UV Norland adhesivo de curado), tanto en la lente o en la cara paquete. Reunir a los dos componentes en contacto mediante el uso de los posicionadores manual. Exponer la interfaz a la luz ultravioleta de la dosis recomendada por el fabricante. </li><li> Para proteger la lente GRIN y al interfaz conjunto, una longitud de tubo de aluminio capilar (Small Parts Inc.) puede ser usado para encerrar la articulación. Deslice la tubería sobre la articulación y la seguridad en el lugar con epoxy. Tubería del encogimiento del calor se puede utilizar para terminar el montaje. </li></ol> 3. Microendoscope imágenes <ol><li> Aplicar el agente de contraste a las células o tejido que se va a examinar. Con proflavina (0,01% w / v en PBS), en las imágenes in vitro de las células en cultivo puede realizarse mediante la incubación breve (&lt;1 minuto) y enjuague. Imágenes de los especímenes de tejido ex vivo o in vivo en los tejidos es posible tras la aplicación tópica de la tintura. La captación de proflavina bajo estas condiciones se ha encontrado para ser casi instantánea, con las imágenes posible en unos pocos segundos y una duración de varios minutos. </li><li> Coloque el cable de fibra óptica en ligero contacto con la muestra que se va a examinar. Cuando las células de imagen en la cultura o la ex muestras de tejido vivo, se recomienda montar el extremo distal del haz de fibras en un dispositivo de seguridad con las etapas de la colocación manual de los ejes XYZ para la estabilidad durante la exploración. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Una vez montado correctamente, el microendoscope funcionará como un microscopio de epifluorescencia, transmitida a través de una política coherente de fibra óptica de conjunto. Para obtener unos resultados de imagen óptima, se debe prestar atención para asegurar que las tres condiciones clave que se cumplan: <ol><li> La cara proximal del haz de fibras debe ser reflejado en la cámara CCD sin desenfoque, con el fin de lograr la resolución completa del sistema. Figura 2a, b, c muestran una parte de un haz de fibras imágenes con un enfoque pobres, desenfoque ligero, y un buen enfoque, respectivamente. El nivel óptimo de enfoque se encuentra ajustando la posición axial de la lente del objetivo relativo a la cara paquete. </li><li> La cara proximal del haz de fibras debe ser uniformemente iluminada sobre su diámetro total (campo de visión). Como se describe en el texto del Protocolo (1,7), esto se logra mediante la configuración de la óptica de iluminación para la iluminación de Kohler. La Figura 2d muestra una imagen adquirida en una muestra uniforme fluorescente se ilumina en esta configuración preferida, con la Figura 2e demuestra el resultado correspondiente bajo iluminación crítica. En este último caso, la estructura de los LED se crea una imagen en la cara del haz de fibras, lo que resulta en la aparición de este patrón no deseados superpone a la estructura de la muestra real. </li><li> Tanto las caras proximal y distal del haz de fibras debe estar limpia y libre de arañazos y patatas fritas. Figura 2f muestra la presencia de restos unida a la cara paquete, con un daño en la forma de un pequeño chip a las 5 en el perímetro de la fibra. Los escombros pueden ser retirados del paquete se enfrenta a la limpieza de la misma manera como convencionales conectores de fibra óptica, con el papel de la lente y el isopropanol, o fibra óptica estándar de herramientas de limpieza. Si cualquiera de los extremos del haz de fibras está rayado o astillados, o si el paquete se rompe a lo largo de su longitud, la cara puede ser pulido plana en el manual estándar, o las técnicas mecánicas de pulido. Recomendamos 12-15 micras lamiendo el papel de un esmalte grueso inicial, con un toque final en el papel 0.5-1.0 micras. </li></ol> Figura 3a muestra imágenes de 1483 células in vitro, a raíz de etiquetado con la colocación proflavina y la luz del haz de fibras al descubierto en la muestra. Figura 3b muestra la mejora en la resolución espacial y la reducción del campo de visión proporcionada por una lente GRIN 2.5x unido a la punta del paquete. Película 1 muestra imágenes in vivo de la almohadilla de grasa mamaria en un modelo murino. Aquí, un haz de fibras con un diámetro exterior de 0,5 mm (330 micras campo de visión) fue aprobada a través de una aguja de calibre 21 y se dirigen hacia el tejido. Las células grasas son claramente visibles, con el movimiento por el ciclo cardíaco evidente en esta adquisición de 15fotogramas por segundo. La figura 3c muestra imágenes de la mucosa oral en voluntarios humanos sanos, esta vez usando un haz de fibras más grande con 1,5 mm de diámetro exterior (1,4 mm campo de visión). En todos los ejemplos mostrados, proflavina fue utilizado como un agente de contraste fluorescente etiquetado nuclear. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Montaje de la microendoscope de alta resolución (HRME). (A) Diagrama esquemático del sistema de HRME. (B) de la Asamblea de la estructura de soporte óptico-principal. (C) La adición de elementos de óptica, iluminación LED y una cámara CCD. (D) Fotografía del sistema HRME, envasado en un 10 &quot;x 8&quot; x 2,5 &quot;caja. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Configuración del HRME. Ejemplos de imágenes con el paquete de fibra óptica en (a) La concentración pobre, (b) cerca de un buen enfoque, (c) enfoque ideal. En (d), un blanco uniforme fluorescente en el extremo distal del haz es reflejado en Kohler (uniforme) de iluminación. (E) Un blanco fluorescente uniforme imágenes bajo iluminación crítica, con la estructura aparente de la fuente en el objeto. (F) los tejidos y células sueltas se pueden pegar a la cara un haz de fibras, que también es propensa a daños menores en su periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imágenes con la HRME. (A) 1.483 células in vitro, con imágenes de un haz de fibras desnudas (IGN-08/30) después de marcar con proflavina 0,01% (w / v). (B) El mismo 1483 el cultivo de células como se muestra en (a), fotografiado con un haz de fibras con la lente de 2.5x GRIN adjunto. (C) de la imagen de la mucosa normal oral humana in vivo, tras la aplicación tópica de proflavina 0,01% (w / v). Movie 1. Imagen de la almohadilla de grasa mamaria de un ratón a través de la inserción de un 450 micras de diámetro exterior de un haz de fibras dentro de la luz de una aguja de calibre 21 pasado en el tejido. Proflavina 0,01% (w / v) fue entregado en el lugar de imágenes con la misma aguja antes de la inserción de la fibra de imagen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">Haga clic aquí para ver el video</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP y DY no tienen nada que revelar. RRK tiene patentes relacionadas con las plataformas de imágenes microendoscópica.

La técnica de alta resolución microendoscopy descrito aquí proporciona a los investigadores en las áreas de investigación biomédica básica y clínica con un método flexible, robusta y rentable para la visualización de detalles celulares in situ. Se ha descrito un protocolo para el montaje del sistema de imágenes y ha demostrado su uso en cultivo celular in vitro y en animales, y los tejidos humanos in vivo. Mientras que los resultados de las imágenes que aquí se presenta utiliza proflavina como un agente de contraste fluorescente, otros grupos han demostrado las versiones del sistema, con longitudes de onda de la iluminación LED y filtros elegido para que coincida con la excitación / emisión de los espectros de los colorantes 5-7 otras. Resolución y campo de visión-son inicialmente determinado por el espacio de núcleo a núcleo y el diámetro de imagen del haz de fibras ópticas. Hemos utilizado los paquetes con aproximadamente 4 micras núcleo central separación, y los diámetros de imagen de 330 micras (una película), 720 m (Figura 2, Figura 3a, b), y 1400 m (Figura 3c). Los paquetes más pequeños pueden pasar a través de agujas de calibre más estrecho y son mucho más flexibles que las fibras más grandes. Nosotros y otros ocho, en algunos casos, observó la aparición de las emisiones de autofluorescencia de la fibra sí mismo paquete. Cuando se trata de excitar fluoróforos en longitudes de onda UV, o recoger las emisiones en el rango espectral de color rojo, se debe prestar atención al nivel de la autofluorescencia de haces de fibras que contribuye a la señal total medida. Mientras que la mayoría de los trabajos de alta resolución microendoscopy informó a la fecha ha utilizado un haz de fibras desnudas, ampliación adicional puede ser proporcionada por el uso de lentes GRIN unido a la punta distal. Lentes GRIN ofrecen una manera sencilla y económica para aumentar la resolución espacial, a pesar de su susceptibilidad a las aberraciones ópticas y NA limitada es bien reconocida. Si el rendimiento de la lente GRIN es inadecuada para una aplicación particular, GRIN híbrido / objetivos lente esférica 9 o en miniatura asambleas lente del objetivo 10-11 puede ser empleado. El microendoscope de alta resolución se describe aquí funciona básicamente como un gran campo epi-microscopio de fluorescencia, por lo tanto no seccionamiento óptico (como en la microscopía confocal o no lineal) es de esperar. En nuestra experiencia, con 455 nm de excitación y la luz proflavina actualidad como un agente de contraste, la luz se recopilan principalmente a una profundidad que corresponde a una pocas capas de células. Este protocolo debe permitir al lector para montar el microendoscope de alta resolución en el laboratorio, con un tamaño compacto de 10 &quot;x 8&quot;. Si lo desea, el sistema puede ser encerrado en una caja y los componentes eléctricos (LED y una cámara) alimentado por una batería (Figura 1d). Muchas cámaras compactas pueden ser alimentados por la IEEE-1394 (Firewire) y USB de la computadora host.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

Muchos estudios biológicos y clínicos requieren el estudio longitudinal y el análisis de la morfología y función de la resolución a nivel celular. Tradicionalmente, los múltiples experimentos se ejecutan en paralelo, con muestras individuales retirados del estudio en los puntos de tiempo secuencial para la evaluación por microscopía de luz. Varias técnicas de intravital se han desarrollado, con confocal, multifotónica, y la microscopía segundo armónico todos los que demuestren su capacidad de ser utilizado para obtener imágenes in situ 1. Con estos sistemas, sin embargo, la infraestructura necesaria es complejo y costoso, que implican un barrido láser y los sistemas complejos las fuentes de luz. Aquí se presenta un protocolo para el diseño y montaje de una microendoscope de alta resolución que puede ser construida en un día usando fuera de la plataforma de componentes de bajo EE.UU. $ 5.000. La plataforma ofrece flexibilidad en cuanto a resolución de la imagen, el campo de visión y de operación de longitud de onda, y se describe cómo estos parámetros se pueden modificar fácilmente para satisfacer las necesidades específicas del usuario final. Nosotros y otros han explorado el uso de la microendoscope de alta resolución (HRME) en el cultivo celular in vitro 2-5, en extirpado 6 y 2,5 viven los tejidos animales, y en los tejidos humanos in vivo 2,7. Los usuarios han reportado el uso de varios agentes de contraste fluorescentes, incluyendo proflavina 2-4, benzoporfirina derivado monoácido anillo A 5 (BPD-MA), y 6,7 fluoresceína, todos los cuales han recibido completo, o la aprobación de investigación de la FDA para su uso en seres humanos. De alta resolución microendoscopy, en la forma descrita aquí, puede apelar a una amplia gama de investigadores que trabajan en las ciencias básicas y clínicas. La técnica ofrece un método eficaz y económico que complementa la microscopía de sobremesa tradicionales, permitiendo al usuario realizar de alta resolución, imágenes longitudinal in situ.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

En muchas situaciones clínicas y biológicas es conveniente estudiar los procesos celulares a medida que evolucionan en su microambiente nativa. A continuación se describe el montaje y el uso de un bajo costo de fibra óptica de microscopio que puede ofrecer imágenes en tiempo real en el cultivo celular, los estudios en animales y estudios clínicos del paciente.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K vistas.  Rice University. En muchas situaciones clínicas y biológicas es conveniente estudiar los procesos celulares a medida que evolucionan en su microambiente nativa. A continuación se describe el montaje y el uso de un bajo costo de fibra óptica de microscopio que puede ofrecer imágenes en tiempo real en el cultivo celular, los estudios en animales y estudios clínicos del paciente.

Video: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Investigación

Bioingeniería

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-velocidad de barrido y microscopía confocal Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal de imágenes y la Plataforma Microendoscopy Espectroscopia de fibra paquete para no invasiva,<em&gt; En Vivo</em&gt; Análisis de Tejidos

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Configuración optimizada y protocolo para la proyección de imagen de dominio magnético con In Situ la medición histéresis

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Proyección de imagen 3D de alta resolución de la red Neuro-insular del páncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...