Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health, gewähren R01 EB007594, dem Department of Defense Breast Cancer Research Program, Vorschlag BCO74699P7 und die Susan G. Komen Foundation Grant 26152/98188972 finanziert.

1. Mikroendoskops Assembly Das hochauflösende Mikroendoskops hier (Bild 1a) beschrieben werden, sollten als Basis-Konfiguration mit mehreren Varianten möglich in Montage und Anwendung berücksichtigt werden. Wir beschreiben im Detail einer Ausgestaltung der Plattform, die entworfen, um mit Proflavin als fluoreszierende Kontrastmittel verwendet werden soll. Proflavin ist ein heller Kernfärbung mit Peak-Absorptions-und Emissions-Wellenlängen von 445 nm und 515 nm bzw.. Die Verwendung anderer Kontrastmittel wird vom Benutzer verlangen, Anregung, Emissions-und dichroitische Filter entsprechend zu wählen. Verschiedene Elemente des hochauflösenden Mikroendoskops sind allgemeiner Natur und können von mehreren Anbietern bezogen werden. Zum Beispiel sind mechanische Positionierung Komponenten aus Thorlabs, Newport, Linos verfügbar unter anderem. Compact-CCD-Kameras werden von Unternehmen, darunter Point Grey Research, Prosilica und Retiga verfügbar; die Empfindlichkeit der Kamera sollte mit Rücksicht auf die Helligkeit des Fluorophors verwendet werden soll, sowie die gewünschte Bildrate gewählt werden. High-Power Leuchtdioden (LEDs) können von Luxeon, Cree und Nichia unter anderem erreicht werden. LWL-Bündel werden von Sumitomo, Fujikura und Schott zur Verfügung. Bei der Auswahl der Komponenten für eine bestimmte Anwendung, sollte der Nutzer betrachten die inhärenten Beziehungen in der Fluoreszenzmikroskopie zwischen Fluorophor-Konzentration beteiligt, Bleichen, Beleuchtungsstärke, die Empfindlichkeit der Kamera, Verstärkung und Belichtungszeit. <ol><li> Verbinden Sie die 6 &quot;Käfigstäbe auf dem 1,5&quot;-Käfig Stangen, um ein Paar von 7,5 Form &quot;lange Stäbe. Screw diese Stäbe in eine Seite des Klappspiegel-Einheit. Schrauben Sie die 0,5&quot; Stangen an der gegenüberliegenden Seite. Schieben Sie den Käfig Würfel auf den Käfig Stangen, über die beiden unteren durch die Löcher. Schrauben Sie die 2 &quot;Stäbe in die Seite des Käfigs Würfel (Bild 1b). </li><li> Befestigen Sie die Kamera an einen Käfigplatte mit einem C-Mount-Adapter für SM1. Sichern Sie den Käfig Platte auf dem 0,5 &quot;-Käfig Stäbchen, mit dem Gesicht der Klappspiegel-Einheit zu spülen. </li><li> Legen Sie die &quot;tube&quot;-Linse in einen 3 &quot;langen Tubus und sichern Sie das Objektiv mit einem Sicherungsring. Die Brennweite des Objektivs gewählt sein sollte, dass die Kerne der Glasfaser-Bündel von mindestens zwei Pixel abgetastet werden bei der Projektion auf die Kamera. Drop the Emissionsfilter in das Rohr auf der Oberseite des ersten Haltering, und fügen Sie einen anderen Ring, um den Filter zu befestigen. Beachten Sie die Ausrichtung des Filters Konvention angezeigt durch die Filter-Hersteller. Schrauben Sie den Tubus in die Seite des Käfig-Würfel am nächsten an der CCD-Kamera. Beachten Sie, dass in Abbildung 1c, dieses Objektiv und Filter ohne die 3 &quot;Tubus für Klarheit dargestellt. </li><li> Schließen Sie die Kamera an einen Computer und sehen Sie die Bilder auf dem Bildschirm. Richten Sie die Käfig an einem entfernten Objekt und schieben Sie den Käfig Würfel entlang der Schienen bis ein Bild im Fokus. Sperren Sie den Käfig Würfel an dieser Stelle. (Dies ist eine einfache Methode, um sicherzustellen, dass das Rohr Linse ein scharfes Bild entstehen, wenn mit dem Infinity-korrigierte Objektiv kombiniert). </li><li> Legen Sie die dichroitischen Spiegel in die Halterung und stellen bei 45 ° in den Käfig Würfel. </li><li> Schrauben Sie die Objektiv über einen RMS SM1 Gewindeadapter und einem verstellbaren Tubus, in das Gesicht des Käfigs Würfel gegenüber dem Rohr Linsenhalter. Ein z-Übersetzer kann anstelle des verstellbaren Tubus für die Scharfstellung verwendet werden. Screw einen SMA-Anschluss in einen Käfig Platte und befestigen diese an den Stangen, etwa auf den Arbeitsabstand des Objektivs. </li><li> Montieren einer LED auf einem Käfigplatte und schieben Sie auf das Ende der 2 &quot;Stangen. Hinzufügen eine Linse, eine 0,5&quot; Tubus, so dass, wenn dieses Rohr in die Seite des Käfigs Würfel verschraubt ist, wird es ein Bild der LED Form dass füllt den Rücken Apertur des Objektivs. Diese (Kohler-Beleuchtung)-Konfiguration wird sichergestellt, dass der proximalen Stirnseite des Glasfaser-Bündel gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Fügen Sie die Anregungsfilter dem 0,5 &quot;Tubus und sichere Stelle mit einem Sicherungsring (Abbildung 1c). </li><li> Bringen Sie einen SMA-Stecker an ein Glasfaser-Lichtleiter. Schrauben Sie die SMA konfektionierte Bündel in die SMA-Buchse auf der Käfigstäbe montiert. Direkte das distale Ende des Bündels zu einer Breitband-Lichtquelle (Leuchtstofflampen genügt) und beobachten Sie das Bild des Bündels proximale Fläche auf dem CCD-Kamera. Passen Sie die Position des Objektivs durch Eindrehen in das oder aus dem Käfig Würfel, bis die Faserbündel Bild erscheint im Fokus. Die einzelnen Kerne sollten deutlich sichtbar sein (Abbildung 2). </li></ol> 2. GRIN-Linse Assembly Die räumliche Auflösung der Mikroendoskops kann durch das Anbringen eines Mikro-Linse oder Linsengruppe, die distale Spitze des Faserbündels erhöht werden. Diese Optiken sind so konfiguriert, dass anstatt die Bündel Spitze direkt auf das Gewebe, die Spitze auf der Gewebeoberfläche mit Verkleinerung abgebildet wird, wodurch die räumliche Sampling-Frequenz von Licht-guid verhängtIng. Kerne der Faserbündel. Der Grad der Verkleinerung entspricht der Steigerung der räumlichen Auflösung und zur gleichen Zeit, zu einem proportionalen Rückgang der field-of-view. Gradient-Index (GRIN) Linsen-Komponenten sind kompatibel mit Faser-Optik und aus GRINTECH, NSG, Schott, unter anderem zur Verfügung, und kann direkt an der distalen Spitze ein Faserbündel verklebt werden. <ol><li> Wählen Sie eine GRIN-Linse mit der gewünschten Vergrößerung und Arbeitsabstand für Ihre Anwendung. Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Linse, dass der Faserbündel Sie planen, mit der Arbeit übersteigt. Wir empfehlen, dass die Faserbündel und GRIN-Linse auf separaten 3-Achsen manuelle Positionierung Stufen unter einem Low-Power-Mikroskop oder Stereoskop für die exakte Ausrichtung vor dem Kleben montiert werden. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von optischen Klebstoff (zB Norland UV-härtende Klebstoff) entweder auf der Linse oder ein Bündel Gesicht. Bringen Sie die beiden Komponenten in Kontakt mit der manuellen Stellungsregler. Expose die Schnittstelle zum UV-Licht für die Dosierung der vom Hersteller empfohlen. </li><li> Zum Schutz der GRIN-Linse und die gebundene Schnittstelle, ein kurzes Stück Aluminium Kapillarrohr (Small Parts Inc.) können verwendet werden, um das Gelenk zu umschließen. Schieben Sie den Schlauch über die gemeinsame und sichere Stelle mit Epoxidharz. Schrumpfschlauch kann verwendet werden, um die Montage fertig sein. </li></ol> 3. Mikroendoskops Imaging <ol><li> Anwenden des Kontrastmittels in die Zellen oder Gewebe, die abgebildet werden. Mit Proflavin (0,01% w / v in PBS), können in vitro-Bildgebung von Zellen in Kultur durch kurze Inkubation (&lt;1 Minute) und eine gründliche Spülung durchgeführt werden. Imaging von ex vivo Gewebeproben oder in vivo Gewebe ist möglich, nach topischer Anwendung des Farbstoffs. Die Aufnahme von Proflavin unter diesen Bedingungen wurde festgestellt, dass nahezu sofortige, mit bildgebenden möglich innerhalb weniger Sekunden und dauert mehrere Minuten. </li><li> Legen Sie die LWL-Bündel in leichten Kontakt mit der Probe, die abgebildet werden. Beim Abbilden Zellen in Kultur oder ex vivo Gewebeproben, empfehlen wir die Montage der distale Ende des Faserbündels in eine sichere Befestigung mit manueller Positionierung Etappen auf XYZ-Achsen für Stabilität während der Bildgebung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wenn richtig montiert, wird der Mikroendoskops als epi-Fluoreszenz-Mikroskop, durch einen kohärenten Glasfaser-Bündel weitergeleitet zu betreiben. Für eine optimale Bildqualität zu erzielen, sollten darauf achten, dass drei Bedingungen erfüllt sind zu zahlen: <ol><li> Die proximale Fläche des Faserbündels sollte auf die CCD-Kamera ohne Unschärfe abgebildet werden, um die volle Auflösung des Systems zu erreichen. Abbildung 2a, b, c zeigen einen Teil einer Faserbündel mit schlechter konzentrieren abgebildet, leichte Unschärfe und eine gute Konzentration, bzw.. Die optimale Konzentration wird durch Einstellen der axialen Position des Objektivs in Bezug auf das Bündel Gesicht gefunden. </li><li> Die proximale Fläche des Faserbündels sollten gleichmäßig über den gesamten Durchmesser (field-of-view) beleuchtet werden. Wie in dem Protokoll Text (1,7) beschrieben, wird dies durch die Konfiguration der Beleuchtungsoptik für Kohler-Beleuchtung erreicht. Abbildung 2d zeigt ein Bild erworben, wenn eine einheitliche fluoreszierenden Probe in dieser bevorzugten Ausgestaltung beleuchtet wird, mit Abbildung 2e zeigt das entsprechende Ergebnis unter kritischen Beleuchtung. Im letzteren Fall ist die Struktur der LED auf die Faserbündel Gesicht abgebildet, was das Erscheinungsbild dieser unerwünschtes Muster auf die wahre Struktur der Probe überlagert. </li><li> Sowohl die proximalen und distalen Flächen der Faserbündel sollte sauber und frei von Kratzern und Chips. Abbildung 2f zeigt das Vorhandensein von Ablagerungen an dem Bündel Gesicht, mit Schäden in Form von einem kleinen Chip um 5 Uhr auf der Faser Umfang. Debris aus dem Bündel Gesichter durch die Reinigung in der gleichen Weise wie herkömmliche Glasfaser-Steckverbindern, mit Objektiv Papier und Isopropanol, oder Standard-LWL-Reinigung von Werkzeugen entfernt werden. Wenn entweder Ende der Faserbündel ist verkratzt oder gesäumt, oder wenn das Bündel bricht entlang seiner Länge, das Gesicht kann flach poliert werden durch Standard-Handbuch, oder mechanisches Polieren Techniken. Wir empfehlen 12-15 um Läppen Papier für eine erste grobe Politur, mit einer abschließenden Politur auf 0,5-1,0 um Papier. </li></ol> Abbildung 3a zeigt Bildgebung von 1483 Zellen in vitro, nach Markierung mit Proflavin und leichte Platzierung der bloßen Faserbündel auf die Probe. Abb. 3b zeigt die Verbesserung der räumlichen Auflösung und Reduzierung in field-of-view von einem 2,5-GRIN-Linse geklebt, um das Bündel Spitze versehen. Movie 1 zeigt in-vivo-Bildgebung des Brustfettpolster in einem Mausmodell. Hier wurde ein Faserbündel mit 0,5 mm Außendurchmesser (330 um field-of-view) durch eine 21-Gauge-Nadel weitergegeben und Fortgeschrittene in das Gewebe. Fettzellen sind deutlich sichtbar, mit der Bewegung durch den Herzzyklus offensichtlich in dieser Akquisition bei 15Frames pro Sekunde. Abbildung 3c zeigt die Abbildung der Mundschleimhaut in einem gesunden menschlichen Freiwilligen, diesmal mit einem größeren Faserbündel mit 1,5 mm Außendurchmesser (1,4 mm field-of-view). In allen Beispielen gezeigt wird, wurde Proflavin als Kernfärbung fluoreszierende Kontrastmittel verwendet. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Montage der hochauflösenden Mikroendoskops (HRME). (A) Schematische Darstellung der HRME System. (B) Versammlung der wichtigsten optomechanischen Tragstruktur. (C) Zusatz von optischen Elementen, LED Beleuchtung und CCD-Kamera. (D) Foto des HRME System, in einer 10 &quot;x 8&quot; x 2,5 &quot;-Gehäuse verpackt. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Einrichten der HRME. Beispiele für Bildgebung mit der Glasfaser-Bündel in (a) schlechte Konzentration, (b) eine gute Konzentration zu schließen, (c) ideal zu konzentrieren. In (d), ist eine einheitliche fluoreszierenden Ziel auf das Bündel der distalen Spitze unter Kohler (Uniform) Beleuchtung abgebildet. (E) Eine einheitliche fluoreszierenden Ziel abgebildet unter kritischen Beleuchtung, mit der Source-Struktur deutlich auf das Objekt. (F) Lose Gewebe und Zellen können die Faserbündel Gesicht, das ist auch anfällig für kleinere Schäden an seiner Peripherie-Stick. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Imaging mit dem HRME. (A) 1483 Zellen in vitro, mit einem nackten Faserbündel (IGN-08/30) nach Markierung mit Proflavin 0,01% (w / v) abgebildet. (B) Das gleiche 1483 Zellkultur als in (a) gezeigt, mit einem Faserbündel mit 2,5 GRIN angesetztem Objektiv abgebildet. (C) Bild der normalen menschlichen Mundschleimhaut in vivo, nach topischer Anwendung von Proflavin 0,01% (w / v). Movie 1. Imaging der Brustfettpolster einer Maus durch Insertion eines 450 um Außendurchmesser Faserbündel in das Lumen eines 21-Gauge-Nadel in das Gewebe geleitet. Proflavin 0,01% (w / v) wurde die Bildgebung vor Ort durch die gleiche Nadel vor dem Einsetzen der bildgebenden Faser. Ausgeliefert <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP und DY haben nichts zu offenbaren. RRK hält Patente im Zusammenhang mit mikro Imaging-Plattformen.

Das hochauflösende Mikroendoskopie hier beschriebene Technik stellt Forscher in der biomedizinischen und klinischen Forschung Gebieten mit einer flexiblen, robusten und kostengünstigen Methode zur Visualisierung zellulärer Details in situ. Wir haben ein Protokoll für die Montage der Imaging-System beschrieben und demonstriert ihre Verwendung in der Zellkultur in vitro und in tierischen und menschlichen Geweben in vivo. Während die bildgebenden hier vorgestellten Ergebnisse Proflavin als fluoreszierende Kontrastmittel verwendet werden, haben andere Gruppen Versionen des Systems mit LED-Beleuchtung Wellenlängen und Filter gewählt Anregungs / Emissionsspektren anderer Farbstoffe 5-7 Match unter Beweis gestellt. Auflösung und field-of-view werden zunächst durch die Kern-zu-Kern-Abstand-und Imaging-Durchmesser der Glasfaser-Bündel bestimmt. Wir haben Bundles mit ca. 4 um Kern-Kern-Abstand und Imaging-Durchmesser von 330 um (Film 1), 720 mu m (Abbildung 2, Abbildung 3a, b), und 1400 um (Abbildung 3c) verwendet. Die kleinere Bündel durch engere Gauge-Nadeln weitergegeben werden und sind wesentlich flexibler als die größeren Fasern. Wir und andere 8 haben, in einigen Fällen festgestellt, das Aussehen der Autofluoreszenz-Emissionen aus dem Faserbündel sich. Beim Versuch, Fluorophore bei UV-Wellenlängen anregen, einsammeln oder Emission im roten Spektralbereich, sollten ihr Augenmerk auf das Niveau der Faserbündel Autofluoreszenz Beitrag zur Gesamtentwicklung Messsignal bezahlt werden. Während die meisten der hoch auflösenden Mikroendoskopie Arbeit berichtet to-date hat eine kahle Faserbündel verwendet werden, können zusätzliche Vergrößerung durch die Verwendung von GRIN-Linsen verbunden mit der distalen Spitze gestellt werden. GRIN-Linsen bieten eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, räumliche Auflösung zu erhöhen, obwohl ihre Anfälligkeit für optische Aberrationen und begrenzte NA gut zu erkennen ist. Wenn GRIN-Linse Leistung ist unzureichend für eine bestimmte Anwendung, Hybrid GRIN / sphärische Linse Ziele 9 oder Miniatur-Objektiv 10-11 Baugruppen können eingesetzt werden. Das hochauflösende Mikroendoskops hier beschriebenen wesentlichen arbeitet als wide-field epi-Fluoreszenz-Mikroskop, also auch keine optische Schnitte (wie in der konfokalen Mikroskopie oder nichtlineare) zu erwarten ist. In unserer Erfahrung, mit 455 nm Anregungs-und topischen Proflavin als Kontrastmittel wird das Licht in erster Linie aus einer Tiefe, die ein paar Zellschichten gesammelt. Dieses Protokoll soll dem Leser ermöglichen, die hochauflösende Mikroendoskops am Prüfplatz montieren, mit seinen kompakten Abmessungen von 10 &quot;x 8&quot;. Falls gewünscht, kann das System in einer Box eingeschlossen und die elektrischen Komponenten (LED und Kamera) durch einen Akku (Abbildung 1d) mit Strom versorgt. Viele Kompaktkameras kann durch den IEEE-1394 (Firewire) und USB-Ports des Host-Computers mit Strom versorgt werden.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

Viele biologische und klinische Studien erfordern die longitudinale Untersuchung und Analyse der Morphologie und Funktion mit zellulärer Ebene Auflösung. Traditionell werden mehrere Experimente in parallel laufen, mit einzelnen Proben aus der Studie bei sequentiellen Zeitpunkte für die Beurteilung durch Lichtmikroskopie entfernt. Mehrere intravital Techniken entwickelt worden, mit der konfokalen, Multiphotonen und zweiten Harmonischen Mikroskopie all ihre Fähigkeit bewiesen, für die Bildgebung in situ 1 verwendet werden. Bei diesen Systemen ist jedoch die erforderliche Infrastruktur komplex und teuer, mit Scanning-Laser-Systeme und komplexe Lichtquellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Konstruktion und Montage von einer hochauflösenden Mikroendoskops, die in einem Tag mit off-the-shelf Komponenten für unter 5.000 US-Dollar gebaut werden kann. Die Plattform bietet Flexibilität bei der Bildauflösung, beschreiben field-of-view, und arbeitet bei der Wellenlänge, und wir, wie diese Parameter leicht modifiziert werden, um die spezifischen Bedürfnisse der Endanwender entsprechen. Wir und andere haben den Einsatz der hochauflösenden Mikroendoskops (HRME) in in vitro-Zellkultur 2-5 erforscht, in herausgeschnitten 6 und lebenden tierischen Geweben 2,5 und in menschlichen Geweben in vivo 2,7. Die Benutzer haben die Verwendung von mehreren verschiedenen fluoreszierenden Kontrastmittel, einschließlich Proflavin 2-4, Benzoporphyrin-derivative Monosäure Ring A (BPD-MA) 5, und Fluorescein 6,7, die alle voll erhalten haben, oder Forschungszwecke Genehmigung durch die FDA gemeldet für den Einsatz am Menschen. Hochauflösende Mikroendoskopie, in der hier beschriebenen Form kann auf eine breite Palette von Forschern in der Grundlagen-und klinische Wissenschaften appellieren. Die Technik bietet eine effektive und wirtschaftliche Lösung, die traditionelle Benchtop-Mikroskopie ergänzt, indem es dem Benutzer ermöglicht hochauflösende, Längs-Bildgebung in situ durchzuführen.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In vielen biologischen und klinischen Situationen ist es vorteilhaft, zelluläre Prozesse zu untersuchen, wie sie sich entwickeln in ihrer Muttersprache Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung eines Low-Cost-Glasfaser-Mikroskop, das Echtzeit-Bildgebung in der Zellkultur, Tierversuche und klinische Patientenstudien bieten kann.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.4K Aufrufe.  Rice University. In vielen biologischen und klinischen Situationen ist es vorteilhaft, zelluläre Prozesse zu untersuchen, wie sie sich entwickeln in ihrer Muttersprache Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung eines Low-Cost-Glasfaser-Mikroskop, das Echtzeit-Bildgebung in der Zellkultur, Tierversuche und klinische Patientenstudien bieten kann.

Serie: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Forschung

Biotechnik

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Die richtige Positionierung und Zurückhaltung einer Ratte Hind Extremität für fokussierte hochauflösende Bildgebung von Knochen-Mikroarchitektur mit In Vivo Mikro-Computertomographie

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Optimierte Setup und ein Protokoll für magnetische Domäne Bildgebung mit In Situ Hysterese-Messung

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

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