Los autores desean agradecer al Sr. Sven Holder y el Sr. Stephen Conley por su ayuda inestimable en este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por el Instituto Nacional de Heath [Grant número R00CA134920] y la American Lung Association [Grant número RG-194681-N]. NinePoint Medical Inc. patrocinó los costos asociados con la publicación de este manuscrito.

1. Imaging System Los detalles técnicos de la SIED se han descrito anteriormente 4-6. Circunferencial SIED se llevó a cabo a velocidades de formación de imágenes entre 25 y 100 imágenes por segundo y entre 512 y 2.048 perfiles de profundidad axial por circular en sección transversal imagen. Custom 2,4 Fr (0,8 mm de diámetro) catéteres de exploración helicoidal utilizados en este estudio fueron diseñados para operar a través del puerto de acceso de broncoscopios estándar. Los catéteres consistía en un núcleo óptico interno para enfocar la luz en la pared bronquial y una funda exterior de un solo uso. El cuerpo del catéter se mantuvo estacionaria durante la formación de imágenes, mientras que el núcleo interno se hizo girar a una velocidad entre 25 y 100 Hz y traducido a una velocidad de retirada de entre 1,25 y 5 mm / seg. La resolución axial del sistema fue de 6 mm en el tejido y proporciona una profundidad de imagen que van de 7,3 mm 4-6. Basado en catéter salidas de IED se llevó a cabo en este estudio para replicar en vivo broncoscópica las salidas de IED (Figura 1). Sin embargo, este protocolo también se puede aplicar a imágenes con un sistema óptico de sobremesa (Figura 3 y 4). 2. Imaging System Set-up <ol><li> Encienda el sistema de imágenes </li><li> Establecer y registrar los parámetros de imagen (velocidad de rotación, la velocidad de retroceso, tasa de adquisición de imágenes, etc.) Para el sistema de formación de imágenes SIED utilizado en este estudio, se obtuvieron imágenes a 10-50 fps. </li><li> Conecte catéter hasta el cruce giratorio y el dispositivo retirada. </li><li> Haga girar catéter y verificar la calidad de imagen. Ajuste la alineación del sistema y el desplazamiento cuando sea necesario. </li></ol> 3. Preparación de tejidos <ol><li> Coloque una mesa disponible almohadilla absorbente sobre la mesa de trabajo y la muestra de pulmón conjunto de almohadilla. </li><li> Si la imagen de una muestra ex vivo quirúrgico de un paciente, asegúrese de consultar con el departamento de patología para asegurar que todos los márgenes de resección (márgenes bronquiales, vasculares y del parénquima) han evaluado, documentado y / o removido por un patoLogist. </li><li> Identificar las vías aéreas bronquiales entrar en la pieza de resección en el hilio. Retire cualquier moco visible dentro de la vía aérea utilizando una jeringa dio a luz. Si es necesario, adjunte un segmento más largo de tubo de plástico a la jeringa orificio de succión más profunda dentro de las vías respiratorias. </li><li> Palpar la superficie exterior de la muestra para identificar la lesión de interés. </li><li> Uso de una sonda de metal fino, con cautela navegar a través del árbol bronquial hasta cerca de la lesión de interés. </li><li> Abrir la vía aérea a lo largo de la sonda hasta que la lesión de interés es visible o palpable bajo la mucosa respiratoria. </li><li> Retire con cuidado la sangre o mucosidad de la mucosa que recubre las vías respiratorias de la lesión con un aplicador con punta de algodón. </li><li> Coloque el catéter SIED por encima de la mucosa respiratoria y obtener una imagen para confirmar la lesión está subyacente a la mucosa respiratoria y para identificar una región de imagen de alta calidad de interés para la correlación de la histología. </li></ol> 4. Marcación de tejido <ol> &lt;li&gt; Seleccione la región de interés en la vía aérea sobre la base de los estudios de imagen previos en el Paso 3.8. </li><li> Elegir dos puntos en el tejido a lo largo de la línea deseada de la imagen. Los puntos pueden ser paralela ya sea a la longitudinal (Figura 2) o circunferencial (Figura 3) aspecto de la vía aérea, dependiendo de los resultados deseados. Puntos espaciales no más de 1,5 cm de separación de modo que la porción de tejido que puede encajar en el bloque histología otro para el procesamiento. Si una longitud de tejido de&gt; 1,5 cm se requiere, a continuación, dividir la longitud de tejido en múltiples 1,5 cm de largo entintadas regiones de interés para crear imágenes múltiples encontrados: pares histología. </li><li> Sumerja una punta fina aguja agujero abierto (es decir, de calibre 25 7/8 &quot;de largo) en el tejido de marcado tinte (Triángulo de Ciencias Biomédicas, Durham, NC). </li><li> Limpie cuidadosamente el exceso de tinta de la parte exterior de la aguja con una gasa, dejando tinta tejido marcando sólo en la aguja de taladro. </li><li> Perforar el tejido perpendicular a la mucosa respiratoria en elelegido punto a lo largo de la línea de formación de imágenes. </li><li> Repita los pasos 3,3 a 3,5 para el segundo punto de la mucosa respiratoria. </li><li> Si la tinta corre sobre la superficie de la mucosa de distancia desde el sitio de punción, utilizar un aplicador con punta de algodón para quitar cuidadosamente el exceso de tinta. </li><li> Eliminar el moco o sangre en la superficie de la mucosa respiratoria con un aplicador con punta de algodón, si está presente. </li><li> Si los puntos de tinta se colocan de forma circunferencial dentro de una vía aérea, es útil a la patilla abierta a los dos lados de la vía respiratoria para aplanar el tejido en el campo de la imagen (Figura 3a). </li></ol> 5. Tisular <ol><li> Coloque el catéter a través de las salidas de IED cada marca de tinta y de imagen para garantizar las marcas son visibles en las salidas de IED. Marks debe aparecer como perturbaciones focales dentro de la estructura del tejido que recubre con partículas de alta dispersión y atenuación de la señal subyacente rápido, que corresponde a las partículas de tinta en el sitio de la punción (Figura 3b, la figura 4a, Figura 4g </strong&gt;). </li><li> Si la tinta marca (s) no son visibles en las salidas de IED, repita los pasos 4,3 a 4,7 para las marcas no visibles. Si las marcas de tinta son visibles con las salidas de IED, vaya al paso 5.3. </li><li> Coloque el catéter paralelo a las dos marcas de tinta en la superficie de las vías respiratorias mucosa tal que la óptica de catéter recubrir el tejido más allá de la marca de tinta primero (figura 2b). Anclaje del extremo proximal del catéter con un objeto ligero y asegurar el extremo distal puede ayudar a reducir los artefactos de movimiento. </li><li> Continuar con la recolección de un pullback SIED. </li><li> Ver las imágenes retirada de SIED para asegurar que ambas marcas de tinta son visibles en las imágenes y para verificar si los artefactos de movimiento (Figura 3 y Figura 4). Si las marcas no son visibles, repita los pasos 5.1 a 5.4. </li></ol> 6. Recolección y procesamiento de tejidos <ol><li> Colocar un punto de tinta verde (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) en el tejido mucoso vía aérea para orientar el comienzo del estudio de imágenes, 0,3 cm de distancia de the marca de tinta que apareció por primera vez en la retirada de imágenes (Figura 2c). </li><li> Quitar el tejido que abarca las dos marcas de tinta negra y tinta marca verde. Recortar el tejido para encajar en un casete de histología estándar de procesamiento. Si el corte de tejido fresco es difícil, entonces el tejido puede ser fijada antes de retirar el tejido para histología. </li><li> Place tejido en un casete de procesamiento histología y fijar en formalina al 10% durante al menos 48 h. </li><li> Proceso de tejido en un procesador de tejido, disponible a través de cualquier departamento de histología. </li><li> Insertar tejido en parafina de manera que las secciones de corte será paralela a las dos marcas de tinta negra en la superficie de las vías respiratorias. </li><li> Utilice un microtomo de tejidos para afrontar el bloque de parafina hasta que una marca de tinta es visible o la sección de tejido entero es visible, lo que ocurra primero. </li><li> Una vez que ambas marcas de tinta negra son visibles, corte una sección de 5 micras de grosor y montar en un portaobjetos de vidrio. </li><li> Continuar para cortar y montar secciones de 5 micras de espesor cada50 micras hasta que las marcas de tinta negra ya no son visibles o los extremos del tejido, lo que ocurra primero. </li><li> Siga estándar de hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción protocolos para manchar cubreobjetos y portaobjetos. </li></ol> 7. Procesamiento de imágenes Si las imágenes se adquirieron con un escáner de sobremesa, o técnica de escaneo otra donde ambas marcas de tinta eran visibles en una sola imagen transversal, a continuación, la imagen se puede correlacionar directamente con la histología correspondiente. Si los conjuntos de datos volumétricos fueron adquiridas con un catéter de exploración helicoidal, las imágenes tendrán que ser re-interpolados para que una imagen 2D único biseca ambas marcas de tinta para la correlación con la histología. Esto se puede lograr usando ImageJ u otro software de procesamiento de imágenes. En algunos casos, la tinta puede no ser fácilmente visible, en cuyo caso las secciones adyacentes / diapositivas deben ser examinados.

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Evaluación de los cánceres de pulmón a tiempo puede ser muy difícil debido a la falta de síntomas y la incapacidad de visualizar los primeros cambios neoplásicos o radiológicamente broncoscópicamente. Las salidas de IED ofrece cerca resolución histológica, amplia zona de 3 dimensiones de la microestructura del tejido vistas en tiempo real 2-6. Endobronquial SIED ha sido demostrada en pacientes como una técnica segura que se puede utilizar para obtener de alta resolución de conjuntos de datos volumétricos sobre segmentos largos vías respiratorias en las vías respiratorias pulmonares 11-13 (Animación). Sin embargo, sólo pequeñas biopsias se obtienen como homólogos histopatológicos en el entorno en vivo, que no proporcionan correlaciones adecuadas para SIED para el desarrollo de criterios de imagen para la patología pulmonar. Con el fin de evaluar con precisión las características de SIED visto en proyección de imagen pulmonar, es esencial para obtener la imagen exactamente a la histología correlaciones. Se presenta un método sencillo y eficaz para precisa, uno a Ocorrelación entre las salidas de IED ne e histología aplicada a las vías respiratorias de imágenes de los ex muestras de resección pulmonar in vivo, que es aplicable a casi cualquier tipo de tejido ex vivo. Una vez que los criterios de imagen se han establecido ex vivo con acertaron una-a-uno histología, estos criterios, entonces se puede aplicar a imágenes in vivo. El tinte del tejido utilizado para marcar la zona de imagen de interés es claramente visible tanto en las salidas de IED y la histología. Mediante el uso de técnicas sencillas para orientar el tejido, las marcas de tinta puede ser correlacionado tanto en imágenes y la histología para permitir doce y cincuenta y nueve de la noche comparaciones de características de SIED y hallazgos histológicos para determinar las características de formación de imágenes identificables de la patología del tejido. La técnica es barato y práctico, por lo que es útil en muchas aplicaciones de formación de imágenes ópticas. En el entorno en vivo, métodos tales como el marcado con láser se puede utilizar para la orientación del tejido 25. Sin embargo, tél pequeño tamaño de la biopsia bronquial es todavía un factor de limitación en el uso de los estudios in vivo para desarrollar criterios específicos de formación de imágenes para la patología pulmonar. Aunque los estudios ex vivo servir como una alternativa adecuada para la formación de imágenes in vivo, existen algunas limitaciones. Ex muestras de pulmón in vivo se muestran a menudo sin inflar y atelectasia inducida quirúrgicamente, lo que altera la apariencia de las estructuras alveolares normales. Inflar el tejido pulmonar resecado quirúrgicamente con marcación de tejido para la correlación histológica es técnicamente difícil ya que la mayoría de las muestras de pulmón quirúrgico se reciban después de la evaluación patología sección congelada durante el cual la superficie pleural se interrumpe, lo que interfiere con la inflación muestra. No patológico atelectasia no es un artefacto visto en el escenario en vivo, por lo que esta limitación no sería pertinente para la formación de imágenes in vivo pulmonar. Además, la falta de sangre dentro de los vasos en muestras ex vivo podría hacer difícil distinguish estructuras vasculares de otras estructuras de señal vacíos. En el entorno en vivo, la adición de Doppler octubre / SIED 26-28 estructural a octubre / SIED sería ayudar en la identificación de los vasos. Artefactos de movimiento se puede ver en vivo donde no están presentes ex vivo. Esto podría ser potencialmente problemática en los sistemas de octubre estándar con velocidades de adquisición más lentas. Sin embargo, las velocidades de cuadro rápidas de los sistemas de salidas de IED se encuentran actualmente&gt; 200 fps 29-31. Por lo tanto, no se espera que un artefacto de movimiento será un problema significativo. Anterior en vivo OCT y estudios de imagen han demostrado SIED visualización satisfactoria de características de las imágenes finas 14,15,18,19. En este estudio hemos demostrado volumétrica SIED con correlación precisa de tejido basado en el diagnóstico para la evaluación de la patología pulmonar. El procedimiento descrito está destinado a proporcionar histología ajustan con precisión para ser utilizado como oro Standaª de la interpretación de las imágenes salidas de IED. Una vez que los criterios de imagen específicos para la patología pulmonar se han desarrollado y validado ex vivo con acertaron una-a-uno histología, los criterios, entonces se puede aplicar a posterior en vivo en los estudios de formación de imágenes con el uso de una biopsia bronquial como una evaluación estándar de oro de la formación de imágenes características visto. Esta técnica se presenta como una aplicación a muestras de resección pulmonar, pero puede ser aplicado a casi cualquier tipo de tejido para proporcionar la imagen precisa para histología correlación necesaria para determinar características finas de formación de imágenes de los tejidos normales y patológicos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Marcación de tejido tinte </td><td> Triángulo Biomédica </td><td> TMD-BK, TMD-G </td><td></td></tr></tbody></table>

optical frequency domain imaging of ex vivo pulmonary resection specimens: obtaining one to one image to histopathology correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Las marcas de tinta negra debe estar entre 1 a 1,5 cm de distancia para indicar la región de imagen de interés. La marca de tinta verde debe ser colocado al principio de la exploración de imagen, antes de la primera marca de tinta negro para orientar la muestra (Figura 2 y la Figura 3a). Marcas de tejido de tinta debe ser visible tanto en las salidas de IED de imágenes y la histología (Figura 3 y 4). En los cerdos normales (Figura 3) y las vías respiratorias humanas (Figura 4), ​​capas de las vías respiratorias típica debe ser visible. El epitelio (E) es visible como una delgada, moderadamente señal de la capa densa, homogénea en el aspecto luminal de la vía aérea. La lámina propia consiste organizada señal intensa de señal pobre en tejido, correspondiente a los diversos componentes de la lámina propia (LP), tales como señales intensas tejidos conectivos incluyendo elastina y el colágeno (EL), y pobre de la señal de tipo salival tejido glandular (G ). Hay señales de vez en cuando los conductos visibles pobres (D) que atraviesan la respiepitelio respiratoria para conectar con el lumen bronquial. El músculo liso se presenta como discontinuos, intercalados fascículos musculares lisas y no es así identificada en las salidas de IED. En la H &amp; E y manchas tricrómico, capas vías respiratorias puede ser visualizada (Figura 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e, y 4f), donde en tricrómico las superficiales tejidos densos elásticas y colágenas aparecer azul profundo y el músculo liso subyacente Las manchas de color rojo (SM). Anillos de cartílago (C) aparecen como poca señal en forma de medialuna estructuras con límites bien definidos, que se solapan en la vía respiratoria porcina y no se solapan en las vías respiratorias humanas. El pericondrio que rodea los anillos de cartílago aparece como una capa delgada de tejido señal intensa que abarca los anillos de cartílago con poca señal. En el periférico vías respiratorias humanas (Figura 4g y 4h), archivos adjuntos alveolar (A) son visibles como finas, intensas como señal de celosía paredes alveolares con espacios vacíos de señal alveolares. Espacios vasculares dentro de la lámina propia son visible como estructuras de señal de vacío lineales o circulares con artefacto sombreado suave subyacente (flechas). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" /> Figura 1. Las salidas de IED de la especie porcina vías respiratorias. Imágenes in vivo obtenidos a partir de una vía respiratoria porcina en ventilación mecánica. (A) ODFI sección transversal de la vía aérea proximal. (B) SIED sección transversal de la vía aérea distal. (C) ODFI sección longitudinal de la vía aérea proximal, una mayor ampliación de imagen de Panel E en la región resaltada en rojo. (D) las salidas de IED sección longitudinal de la vía aérea distal, mayor magnificación de imagen e panel en la región verde resaltado. (E) ODFI sección longitudinal de la vía aérea de proximal a distal (izquierda a derecha). Catéter diámetro es de 0,8 mm y marcas de graduación representan incrementos de 0,5 mm. Aunque las diferentes capas de la pared de vía respiratoria y archivos adjuntos alveolares son discernibles en las imágenes de SIED, es difícil de interpretar con precisión la co anatómicarrelate de las señales de salidas de IED sin histología directamente registrados. e: epitelio, lp: lámina propia, sm: submucosa, c: cartílago, a: los archivos adjuntos alveolar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" /> Figura 2. Marcación de tejido de vía respiratoria porcina. (A) Abierto las vías respiratorias con dos marcas de tinta negra en la superficie luminal colocado en paralelo a la cara longitudinal de la vía aérea, 1,5 cm de separación. (B) las salidas de IED catéter colocado sobre dos marcas de tinta negro para incluir ambas marcas dentro de la retirada SIED. (C) las vías respiratorias con marca adicional tinta verde para orientar el comienzo del estudio de imágenes en la muestra. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" /> Figura 3. Las salidas de IED y la histología de las vías respiratorias porcina demostrando cor precisorelación usando marcación de tejido. (a) Abierto las vías respiratorias con dos marcas de tinta negra en la superficie luminal colocado en paralelo a la cara circunferencial de la vía aérea. Patillas se utilizan para abrir más la vía aérea (flechas). (B) las salidas de IED de las vías respiratorias porcina con ambas marcas de tinta visible (asteriscos) con (c) manchado histología precisamente correlacionada con H &amp; E (asteriscos: tinta negro marca visible sobre el epitelio respiratorio) y (d) tinción tricrómica correlacionada. Barra de escala: 2 mm. (E) mayor aumento vista de imagen SIED con (f) correspondiente histología teñidas con H &amp; E y (g) tinción tricrómica correlacionada. E: epitelio respiratorio, EL: colágeno denso y tejidos elásticos, SM: músculo liso, C: anillos cartilaginosos (artefacto histológico ha dado lugar a la separación artificial de los anillos cartilaginosos), G: tejido de la glándula salival, D: conducto salival entrar epitelio. Barra de escala: 250 m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" /> Figura 4. SIED y la histología de las vías respiratorias humanas que demuestra una correlación precisa usando marcación de tejido. (A) SIED de las vías respiratorias humanas proximal con dos marcas de tinta visible (asteriscos). (B) manchado Precisamente correlacionada con la histología H &amp; E con tinta negro marca visible sobre el epitelio respiratorio (asteriscos) y (c) tinción tricrómica correlacionada. Barra de escala: 2 mm. (D) Mayor ampliación de la imagen de vista SIED y (e) la histología correspondiente teñidas con H &amp; E y Tricrómico de (f). Barra de escala: 250 m. E: epitelio respiratorio, LP: lámina propia, G: tejido de la glándula salival, C: anillos cartilaginosos, PC: pericondrio. En las vías respiratorias humanas, la estratificación típica es visible. En el tejido conectivo laxo, no se intercalan fascículos de rojo-tinción de músculo liso (SM, c paneles y f), Que no forman una banda continua y por lo tanto no son visibles como una capa distinta en las salidas de IED. (G) las salidas de IED de las vías respiratorias humanas distal y (h) precisamente correlacionada H &amp; E histología con las marcas de tinta negros visibles sobre el epitelio respiratorio (asteriscos). Barra de escala: 2 mm. Adjuntos alveolar (A) son accesibles como señales intensas como celosía paredes alveolares con espacios vacíos de señal alveolares. Espacios vasculares dentro de la lámina propia también son visibles como estructuras de señal de vacío-con sombreado subyacente leve (flechas).

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Un método para la imagen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Muestras de resección pulmonar con óptica de imágenes de dominio de frecuencia (IED) y obtener una correlación precisa para histología se describe, que es esencial para el desarrollo de criterios específicos de interpretación de SIED para la patología pulmonar. Este método es aplicable a otros tipos de tejidos y técnicas de formación de imágenes para obtener imágenes precisas de correlación histología para la interpretación precisa de la imagen y de evaluación. Criterios de imagen establecidos con esta técnica sería entonces aplicable a la evaluación de imagen en el futuro<em&gt; In vivo</em&gt; Estudios.

Frecuencia de imagen óptica de dominio de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Piezas de resección pulmonar: Obtención de One to One de imagen para estudio histopatológico de correlación

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

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Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

14.0K vistas.  Harvard Medical School. Un método para la imagen Ex vivo Muestras de resección pulmonar con óptica de imágenes de dominio de frecuencia (IED) y obtener una correlación precisa para histología se describe, que es esencial para el desarrollo de criterios específicos de interpretación de SIED para la patología pulmonar. Este método es aplicable a otros tipos de tejidos y técnicas de formación de imágenes para obtener imágenes precisas de correlación histología para la...

Video: Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Investigación

Bioingeniería

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

La oftalmoscopia integrado fotoacústica y Spectral-tomografía de coherencia óptica de dominio

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a phospholipid and then self-assembled to liposome-like spherical vesicles. Due to the extremely high density of porphyrin in the porphyrin-lipid bilayer, porphysomes generated large extinction coefficients, structure-dependent fluorescence self-quenching, and excellent photothermal efficacy. In our formulation, porphysomes were synthesized using high pressure extrusion, and displayed a mean particle size around 120 nm. Twenty-four hr post-intravenous injection of porphysomes, the local temperature of the tumor increased from 30 &deg;C to 62 &deg;C rapidly upon one minute exposure of 750 mW (1.18 W/cm2), 671 nm laser irradiation. Following the complete thermal ablation of the tumor, eschars formed and healed within 2 weeks, while in the control groups the tumors continued to grow and all reached the defined end point within 3 weeks. These data show how porphysomes can be used as potent photothermal therapy (PTT) agents.

We developed novel intrinsic multifunctional nanovesicles called porphysomes, which have structure-dependent fluorescence self-quenching and unique photothermal properties, thus functioning as potent photothermal therapy agents. We formulated porphysomes using high pressure extrusion and investigated their photothermal therapy efficacy in a xenograft tumor model.

Un Minuto, Sub-Uno-Watt fototérmica Ablación Usando Porphysomes, Intrinsic Multifuncional nanovesículas

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

El uso de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aparato Chandler Loop para evaluar la biocompatibilidad de los conductos sanguíneos poliméricos modificados

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Un método para estimar las cepas Cortical fémur cadavérico durante fractura correlación Digital de imágenes usando la prueba

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...