La medición de especies reactivas de oxígeno o ROS es notoriamente problemática. En este video, demostraremos la medición reproducible de ROS en respuesta al reticulación del receptor FC-gamma utilizando sondas fluorescentes y citometría de flujo. Las principales ventajas de esta técnica son la reproducibilidad del ensayo y el uso de este método con estímulos antigénicos específicos, no sólo mitógenos o inductores ROS conocidos.
La producción de ROS desregulada es fundamental para el desarrollo de muchas enfermedades como la enfermedad granulomatosa crónica o la EC. La medición precisa de la ROS podría constituir una parte del diagnóstico molecular de la EC. Estudiar la producción de ROS mediada por FC es importante en el estudio de las inmunodeficiencias, como la EC, pero también en el estudio de enfermedades autoinmunes, o enfermedades neurodegenerativas, donde demasiado ROS conduce al estrés oxidativo y la inflamación.
El momento del ensayo es crítico. Yo aconsejaría a alguien que intenta este protocolo por primera vez para prepararse a fondo y hacer un experimento simulado si es posible. La demostración visual de este método es fundamental para subrayar los pasos del ensayo que necesitan una atención especial, como el momento del ensayo.
Para comenzar, prepare macrófagos derivados de la médula ósea utilizando medios condicionados como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de cebar los macrófagos durante la noche, aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con PBS. El suero muere de hambre a las células reemplazando los medios con el mismo volumen de DMEM bajo en suero.
Para cada ratón, una placa será tratada con anti-BSA IgG1 mientras el suero se muere de hambre mientras que la otra no se tratará. Añadir sólo DMEM de bajo suero a las placas no tratadas y añadir DMEM de bajo suero que contenga 2,5 microgramos por mililitro de IgG1 de murino anti-BSA a las placas tratadas. Asegúrese de incluir una placa no tratada adicional para cada experimento que actúe como control de compensación citométrica de flujo.
Incubar las placas cuatro horas a 37 grados centígrados, 5%CO2. Durante las cuatro horas de incubación, preparar una solución 2X de las sondas reactivas de especies de oxígeno. Por cada 10 mililitros de DMEM de bajo suero necesarios, agregue cuatro microlitros de un reactivo de detección de esfuerzo oxidativo y cuatro microlitros de un reactivo de detección de superóxido.
A continuación, prepare las soluciones de sonda 2X que contienen solo el reactivo de detección de estrés oxidativo o que contienen solo el reactivo de detección de superóxido. Después de la incubación de cuatro horas, cosecha las células raspando suavemente las placas, recogiéndolas en tubos de fondo redondo etiquetados de cinco mililitros. Centrifugar los tubos a 750 g durante cinco minutos.
Asegúrese de realizar un seguimiento de las células que fueron tratadas con murino anti-BSA IgG1. A continuación, lave los gránulos celulares con dos mililitros de PBS para deshacerse de cualquier anti-BSA residual de las células tratadas. Centrifugar los tubos a 750 g durante cinco minutos.
Luego, aspirar el PBS y resuspender el pellet celular en 600 microlitros de DMEM de bajo suero. A partir de la suspensión de células de 600 microlitros, alícuotas 200 microlitros en los tubos de fondo redondo de cinco mililitros preetiquetados. De las células no tratadas, tomar 200 microlitros para los tubos etiquetados sin estimular, 200 microlitros para los tubos etiquetados inductor positivo, y 200 microlitros para los tubos etiquetados inductor positivo más inhibidor.
Luego, de las células tratadas contra-BSA IgG1, tomar 200 microlitros para tubos etiquetados con el entrecruzamiento del receptor FC-gamma, y 200 microlitros para tubos etiquetados CON el receptor FC-gamma reticulando más inhibidor. De las células no tratadas que se utilizarán para los controles de compensación, tome 200 microlitros para el tubo etiquetado sin astimular, 200 microlitros para el control del inductor verde más, y 200 microlitros para el control de naranja más inductor. Preparar una solución inductor 2X positivo diluyendo la pyocyanina de uno a 100 en cada una de las soluciones de sonda 2X a una concentración de 500 micromolares.
A continuación, prepare una solución de BSA 2X diluyendo la solución de stock de BSA en la solución de sonda 2X para obtener una concentración de 2X de dos microgramos por mililitro. Antes de iniciar la estimulación específica, como la reticulación del receptor FC-gamma, asegúrese de que todos los reactivos y células estén listos y coloque los tubos sobre hielo en el orden en que serán estimulados. Para los citometros de flujo con un muestreador automático, tome nota del tiempo que tarda el citometro en analizar una muestra y pasar a la siguiente.
Asegúrese de incluir cualquier paso de mezcla y lavado de sondas. El tiempo es muy crítico para este ensayo. Para que cada condición esté bien controlada, la estimulación debe llevarse a cabo en exactamente 30 minutos para cada condición.
Estimular las células en orden e incorporar el tiempo de retraso entre las adquisiciones de muestras por el citometro de flujo. Si realiza una compensación manual en este punto, estimule los tubos de control que se utilizarán para la compensación añadiendo 200 microlitros de la solución de sonda 2X que contiene el reactivo de detección de tensión oxidativa y el inductor en los tubos marcados en verde más inductor. A continuación, añada 200 microlitros de solución de sonda 2X que contengan el reactivo de detección de superóxido y el inductor en los tubos marcados como naranja más inductor.
Incubar las células durante 30 minutos en la oscuridad. Usando el software de citometría de flujo, genere y etiquete tres archivos de muestra para el control, sin mancha, sin tratar, el inductor plus verde y las muestras de inductor naranja plus, asegurándose de indicar los canales y parámetros a analizar. Además, introduzca las condiciones de parada deseadas.
Una vez configuradas las muestras de control, genere y etiquete un conjunto similar de archivos para las muestras experimentales. Ahora, ejecuta la muestra sin mancha y sin tratar. Abra un gráfico de puntos para la dispersión hacia delante en el eje X frente a la dispersión lateral en el eje Y y dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las celdas muertas y los desechos.
A continuación, utilice la puerta de esta celda para abrir otra gráfica de puntos del primer marcador de fluorescencia, FL1, en el eje X, frente al segundo marcador de fluorescencia, FL2, en el eje Y. Dibuje una puerta de cuadrante inicial y, a continuación, ajuste la puerta del cuadrante para que los eventos aparezcan en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2. Cuando haya terminado, ejecute la muestra de inductor verde más.
Ajuste el voltaje para que los eventos aparezcan en los cuadrantes inferior izquierdo y derecho de la gráfica FL1 frente a FL2. A continuación, aplique esta matriz de compensación a los tres archivos de ejemplo. Ahora, ejecute la muestra naranja más inductor.
Ajuste el voltaje para que los eventos aparezcan en los cuadrantes superior e inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2 y, a continuación, aplique esta matriz de compensación a los tres archivos de muestra. Compruebe cada archivo de compensación y asegúrese de que los eventos no detenidos y no tratados aparezcan en el cuadrante inferior izquierdo, los eventos de inductor más verde aparecen en los cuadrantes inferior izquierdo y derecho, y los eventos de inductor naranja más aparecen en los cuadrantes superior e inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2. A continuación, aplique la matriz de compensación a todos los archivos de ejemplo experimentales.
Una vez realizada la compensación manual y obtenida una plantilla experimental, pase a las muestras experimentales. Antes de tratar las células con un inductor positivo o realizar la estimulación de la célula del receptor FC-gamma, marque qué tubos obtendrán un inhibidor de la ROS. Tratar estas células con el inhibidor DE ROS al menos 30 minutos antes del inductor positivo o estimulación del receptor FC-gamma añadiendo un microlitro del inhibidor a 200 microlitros de células resuspendidas para una concentración final de cinco mililitros.
Para las células no estimuladas, trate las células con 200 microlitros de la solución de sonda 2X sin ningún estímulo añadido a los 200 microlitros de suspensión celular etiquetados manchados, sin estimulación. Para controles positivos, trate las células con 200 microlitros de la solución inductor 2X positiva a 200 microlitros de suspensión celular etiquetado inductor positivo o inductor positivo más inhibidor. Finalmente, para las células estimuladas por el reticulamiento del receptor FC-gamma, tratarlas con 200 microlitros de la solución 2X BSA añadidas a 200 microlitros de la suspensión celular etiquetada con el receptor FC-gamma reticulante o el reticulante del receptor FC-gamma más inhibidor.
Incubar las células durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, analizar las muestras en el orden en que fueron estimuladas, utilizando el citómetro de flujo y las plantillas de análisis generadas durante los pasos de compensación inicial. Los datos mostrados aquí demuestran la detección citométrica de flujo de la producción reactiva de especies de oxígeno resultante de la estimulación de los macrófagos a través del receptor FC-gamma.
Hay un aumento marcado en la fluorescencia FL1 y FL2 cuando las células se estimulan con el agente reticulante del receptor FC-gamma. Cuando las células fueron tratadas con el inhibidor de especies reactivas de oxígeno antes de la reticulación del receptor FC-gamma, este aumento de la fluorescencia se devuelve a los niveles basales. Por el contrario, estas gráficas de puntos presentan un experimento fallido, donde se observó la producción de especies de oxígeno reactivas subóptimas como resultado de la estimulación del receptor FC-gamma.
Para resaltar las grandes diferencias entre los porcentajes esperados o los aumentos de IMF, estos datos muestran cómo se ven las muestras con un aumento mínimo de la fluorescencia FL1 y FL2. El protocolo actual utiliza un paso de cebado de 24 horas. Al comparar un tiempo de cebado de 24 horas frente a un tiempo de cebado de 48 horas, no hubo diferencia marcada en el porcentaje de células positivas para el reactivo de estrés oxidativo verde.
Sin embargo, aumentar el tiempo de cebado a 48 horas aumentó el porcentaje de células positivas para la fluorescencia naranja. Las cosas más importantes a recordar al realizar este procedimiento es planificar con anticipación, y ser consistente sobre el momento del ensayo para obtener resultados reproducibles.
