Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Damos las gracias a Darwin la horca por su asistencia técnica.

Animal Uso Declaración: Los animales fueron atendidos de conformidad con las directrices descritas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, utilizando los protocolos aprobados por la Universidad de Minnesota Care Animal institucional y el empleo. 1) Preparación de las soluciones <ol><li> Antes de realizar registros electrofisiológicos, las soluciones intracelulares, extracelulares, y la enzima que estar preparados. </li><li> Extracelular solución: mezclar una botella (8,8 g) del medio de polvo de Ames (Sigma) con 1 l de H 2 O y 1,9 g de bicarbonato de sodio (23 mM). En todos los puntos de la solución extracelular está saturado con 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de gases. Transferencia de 200 ml a un vaso de almacenamiento de retina. Ponga la solución queda en el recipiente sistema de perfusión para la perfusión por gravedad una vez la retina se ha montado. </li><li> Solución intracelular: solución intracelular que se han hecho con anterioridad y luego en partes alícuotas 500-1000 alícuotas y almacenado a -20 ° C. Solución intracelular varía en función de la experiencia necesaria, para las grabaciones de pinza de corriente se muestra aquí usamos (en mm): 125 K-gluconato, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH a 7,2 con KOH 5. Un marcador fluorescente como 10 M-594 AlexaFluor hidrazida (Invitrogen) se pueden agregar a visualizar las dendritas durante el experimento, y neurobiotin (0,3%) también pueden ser incluidos para el análisis de la anatomía de la célula después de su registro. Cuando esté listo para grabar, descongelar solución intracelular. </li><li> Solución de la enzima: Combine 10.000 unidades de colagenasa (Worthington productos químicos) con 83 mg hialuronidasa (productos químicos Worthington) en 4.150 ml de la solución extracelular. Almacenar en alícuotas de 50 l a -20 ° C. Alícuotas se puede utilizar por varias semanas. Cuando esté listo para el tratamiento de la retina, se diluye en 500 l alícuota de la solución de burbujas extracelular. </li><li> Solución tampón de fosfato (PBS): en 800 ml de H 2 O añaden 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na 2 HPO 4 y 0,24 g de KH 2 PO 4. Llevar el pH a 7,4 con NaOH. Ajustar el volumen de 1 L. </li><li> Tampón fosfato 0,2 M: En 800 ml de H 2 O añadir 21,8 g de Na 2 HPO 4 y 6,4 g de NaH 2 PO 4. Alcanzar un volumen de 1 L. </li><li> Paraformaldehído al 4% Solución: Heat 50 ml H 2 O a 60 ° C. Añadir 4 g de paraformaldehído, se agita durante varios minutos. Añadir unas gotas de NaOH 1M (alrededor de 5 gotas), seguir revolviendo hasta que la solución es clara. Añadir 50 ml de tampón fosfato 0,2 M en el vaso. Verifique el pH con tiras de pH (~ 7,4). Filtrar y enfriar. </li><li> Solución de bloqueo (10% suero de cabra, un 0,5% TritonX100): En 1,8 ml de PBS añadir 0,2 ml de suero de cabra y 10 l de Triton X-100. TritonX-100 sirve para permeabilizar el tejido. </li><li> Estreptavidina solución (5% suero de cabra, un 0,5% TritonX100, 1:500 estreptavidina 594): En 1,9 ml de PBS, añadir 0,1 ml de suero de cabra, 10 l de Triton X-100 y 4 L de estreptavidina 594. </li></ol> 2) El aislamiento de la retina de ratón Herramientas de disección es necesario: 1 # 2 pinzas, 2 º 5 pinzas, tijeras oftalmológicas <ol><li> Eutanasia ratón de acuerdo a los protocolos aprobados, en este caso asfixia de CO 2 y el globo ocular enucleación, insertando suavemente un ángulo # 2 pinzas detrás del ojo y levantando el globo ocular. </li><li> Lugar del globo ocular en un 35 mm placa de Petri con solución extracelular. Cortar el nervio óptico y los músculos extraoculares adjunto o del tejido conectivo con unas tijeras oftalmológicas. Cortar la córnea con una tijera de oftalmología y tire de la lente usando # 5 fórceps. Romper la esclerótica con un par de pinzas # 5 y el uso de las pinzas para cortar el nervio óptico en la retina y la esclerótica se encuentran en el disco óptico. Con cuidado, vaya de la retina se desprenda de la ojera. Sugerencia: cada paso en ambas retinas antes de pasar al siguiente paso para minimizar el tiempo. </li><li> El uso de fórceps para extraer humor vítreo adherido a la retina. Esto puede ser realizado por &quot;agarrar&quot; el humor vítreo transparente por encima de la retina con una pinza. El humor vítreo, si elimina correctamente, debe ser visible como una sustancia transparente y gelatinosa en las pinzas. Sugerencia: Cortar la retina en la mitad tras la retirada del vítreo maximizará la cantidad de tejido útil y hacer el montaje en la cámara sea más fácil. </li><li> Mantener la retina en la solución extracelular oxigenada a temperatura ambiente en un ambiente oscuro con la luz ambiental mínimo hasta que estén listos para ser digeridos. Retinas se pueden almacenar en esta forma de a 6 horas. </li></ol> 3) Tratamiento de la retina con la mezcla de enzimas y de montaje en la cámara de grabación <ol><li> Diluir una alícuota de la colagenasa / hialuronidasa en 500 l solución extracelular, la solución en lugar de 35 mm placa de Petri y la transferencia de la retina. </li><li> Mantener la retina contienenING placa de Petri, cubiertas y en la oscuridad, en un 95% O2 / 5% CO 2 ambiente durante 15 minutos con agitación suave. Este paso ayuda a digerir cualquier vítreo restante y permite un acceso más fácil a la capa de células ganglionares. Sugerencia: para las retinas de los animales más jóvenes con menos humor vítreo o si se observan efectos adversos, el tiempo se puede acortar a ~ 5 minutos. </li><li> Retire la retina de enzimas que contienen medio y lavar ampliamente en la solución extracelular </li><li> La transferencia de la retina en la grabación de la cámara 6 con la capa de fotorreceptores hacia abajo. Evacuación de la resto de fluido, ya sea con una pipeta o el tejido y el despliegue lados de la retina para aplanar el tejido con cuidado de tocar sólo los bordes de la retina, en particular, evitando el contacto con la capa de células ganglionares. Colocar un anillo de platino con una malla de nylon en la retina para anclar el tejido e inmediatamente llenar la cámara con una solución extracelular. </li><li> Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio, meter un tubo de perfusión por gravedad y succión al vacío y conectar el cable de tierra. </li></ol> 4) La localización de las células ganglionares de la EGFP expresión y la estimulación de luz <ol><li> Perfusión de la retina por la gravedad con solución extracelular en las tasas de 1 mL / min o más rápido. Consejo: Si la tasa de perfusión es demasiado lento, el tejido no será lo suficientemente oxigenada y la señalización sináptica puede ser interrumpido. </li><li> Llenar una pipeta de grabación con la solución intracelular y la inserta en el soporte de la pipeta. Sugerencia: Las pipetas con resistencias en el rango de 3 a 5MΩ dar los mejores resultados. </li><li> Visualizar la retina bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica a bajo aumento (objetivo de 10X, NA 0,3) para localizar la pipeta de grabación. La luz infrarroja se utiliza para minimizar la exposición de la retina a la luz visible y minimizar la adaptación a la luz. Mover a un mayor aumento (objetivo de 40X, NA 0.8) y llevar el electrodo en vista justo por encima de los tejidos. </li><li> A mayor aumento (objetivo 40X), iluminar la retina con epifluorescencia (480 nm para EGFP) y seleccione una de las células ganglionares fluorescente y marca de monitor de ordenador con cinta (fig. 1A). </li><li> Bajo iluminación DIC y de infrarrojos, la posición del electrodo de registro cerca de las células ganglionares específicas (Figura 1). Limpie el área que cubre inmediatamente la célula mediante la aplicación de presión positiva suave para electrodo de registro a través de una jeringa de plástico de 12cc conectada a la titular de la pipeta con tubería de polietileno. En el amplificador, las compensaciones a cero de tensión. Electrodo en lugar de las células ganglionares seleccionado hasta que aparece un hoyuelo en la superficie celular. </li><li> Con el amplificador en el modo de fijación de voltaje, aplicar un pulso de prueba y controlar la corriente que pasa a través de la pipeta. Aplicar presión negativa para crear el sello entre el electrodo y celular. De liberación de presión negativa cuando la célula empieza a sellar y esperar a que la celebración actual es indicativo de un sello GΩ eléctrico entre la membrana celular y la pipeta. Aplicar suaves pulsos de presión negativa hasta que aparecen los transitorios capacitivos y luego suelte cualquier aplicación de presión. Consejo: si el acceso (la serie) la resistencia es alta (&gt; 30MΩ), esto a menudo puede ser mejorado por otros, muy suave, los pulsos de presión negativa. </li><li> Una vez que un sello estable se ha llegado a aplicar un pulso de presión negativa. Después del modo de célula completa se obtiene, permitirá la célula para adaptarse oscuridad durante 5 minutos. Registro, en el modo de corriente con la pinza, la respuesta a campo completo, la estimulación de luz blanca (fig. 1B). </li><li> Después de su registro, AlexaFluor-594 se han difundido a las dendritas. El marcador puede ser visualizado en epifluorescencia a 594 nm y se utiliza para determinar si una célula ganglionar es-On, Off-o bi-estratificado por cambiar de óptica infrarroja epifluorescencia y DIC 5. </li><li> Si neurobiotin está incluido en la pipeta y la retina va a ser procesadas para inmunohistoquímica, entonces pipeta suavemente retraído para proporcionar una mínima interrupción de la membrana. </li></ol> 5) Análisis de la anatomía de las células ganglionares registrado Llenado con neurobiotin permite un análisis más detallado morfológicas de las células ganglionares después de su registro. Consejo: Si las correlaciones específicas entre las células ganglionares registrado y la morfología detallada que se desea, puede ser mejor para grabar y completar una sola RGC por la preparación. <ol><li> Si neurobiotin fue incluido en la solución intracelular luego colocar la retina en la solución de paraformaldehído y fijar la noche a 4 ° C. </li><li> Enjuague en PBS, por lo menos 2 horas, por lo menos 6 cambios. La transferencia de la retina a una placa que contiene la solución de bloqueo. Deja en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente en la coctelera. </li><li> Reemplace la solución de bloqueo con la solución de estreptavidina. Incubar 2 días a 4 ° C en el agitador. Enjuague la retina en PBS, 6 enjuagues, 20 min cada uno. </li><li> Monte la retina con Vectashield en un portaobjetos de vidrio.La retina se debe colocar con las células ganglionares de arriba. Realizar microscopia confocal (fig. 1C). </li></ol> Resultados representante Si la retina está sana y la disección se ha realizado correctamente, las células ganglionares de la persona deben ser visibles en la CID a gran aumento (fig. 1A). Retinas no saludables se tienen grandes núcleos, granulado y debe ser desechado. Si la respuesta sináptica de las células ganglionares dado está intacta, la célula debe responder al inicio de la luz o el desplazamiento de los potenciales de acción y, en el caso de una de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles-(fig. 1B), una despolarización sostenida. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Localización, registro y tinción de las células ganglionares de la retina marcados con fluorescencia. (A) RGC GFP positivos visualizado bajo iluminación epifluorescencia con un aumento de 40X (izquierda) y con iluminación DIC (panel derecho). (B) respuesta a la luz de una Synaptic células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles M2 registró en su conjunto de células modo de pinza de corriente de la CGR, marcados con fluorescencia. (C) M1 células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles que se identificó bajo epifluorescencia, blanco de células enteras de grabación, llenos de neurobiotin, y luego procesadas para inmunohistoquímica.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Esta técnica es aplicable a todas las grabaciones de células ganglionares de la retina de una retina aislada. Aunque en la línea de ratón utilizado anteriormente intrínsecamente fotosensibles, melanopsina expresar CGR se etiquetan con EGFP 2, 5, este protocolo es fácilmente transferible a otras líneas de marcado con fluorescencia RGC o puede ser generalizada para grabar desde CGR seleccionados al azar también. Esta técnica es particularmente útil debido a que el cenador dendríticas de cada CGR y su...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

Los primeros pasos en la visión de los vertebrados tienen lugar cuando la luz estimula los fotorreceptores de los bastones y conos de la retina 1. Esta información es luego separada en lo que se conoce como las vías de ON y OFF. La información fotorreceptores señal de luz a las células bipolares (BC), que despolarizan en respuesta a los aumentos (en BC) o disminuye (Off BCS) en la intensidad de luz. Esta separación de la luz información se mantiene en el nivel de las células ganglionares de la retina (CGR), que tienen dendritas estratificación, ya sea en el sublamina fuera de la capa plexiforme interna (IPL), donde reciben la entrada de excitación directa de Off chalecos, o la estratificación en En el sublamina de la IPL, donde reciben la entrada de excitación directa de El BCS. Esta segregación de información acerca de los aumentos o disminuciones en la iluminación (el encendido y apagado vías) se conserva y señaló que el cerebro de forma paralela. La CGR son las celdas de salida de la retina, y por lo tanto una importante célula de estudio con el fin de entender cómo la luz información es transmitida al núcleo visual en el cerebro. Los avances en la genética del ratón en las últimas décadas han dado lugar a una variedad de líneas fluorescentes reportero del ratón en poblaciones específicas de RGC están etiquetados con una proteína fluorescente para permitir la identificación de los subtipos de RGC 2 3 4 y orientación específica para el registro electrofisiológico. A continuación, presentamos un método para registrar las respuestas de la luz de las células ganglionares de la etiqueta fluorescente en una preparación intacta, la retina aislada. Esta preparación la retina aislada permite grabaciones de CGR en la glorieta dendríticas está intacto y las entradas a través de la glorieta dendríticas RGC todo se conservan. Este método es aplicable en una amplia variedad de subtipos de células ganglionares y se presta a una amplia variedad de una sola célula técnicas fisiológicas.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vistas.  University of Minnesota. Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Un aplastamiento del nervio óptico Lesiones modelo murino para estudiar la supervivencia de células ganglionares retinianas

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Aislamiento de retina de ratón y tratamiento con metanol para el estudio de las células ganglionares de la retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor destacado: Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de las células ganglionares de la retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...