وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01EY012949 ، R21EY018885 ، T32 EY0707133. نشكر داروين هانغ على مساعدته التقنية.

بيان استخدام الحيوان : لم يهتم للحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المبينة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ، وذلك باستخدام البروتوكولات التي وافقت عليها جامعة مينيسوتا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام. 1) إعداد حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إجراء تسجيل الكهربية ، والحلول بين الخلايا ، خارج الخلية ، والانزيم ابد أن نكون مستعدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية الحل : مزيج زجاجة واحدة (8.8g) من مسحوق المتوسطة أميس &#39;(سيغما) مع 1 لتر من H 2 O و 1.9 غرام من بيكربونات الصوديوم (23 ملم). في جميع نقاط مشبعة حل خارج الخلية مع O 95 ٪ 05/02 ٪ خليط أكسيد الكربون غاز 2. نقل 200 مل إلى الدورق لتخزين شبكية العين. وضع حل المتبقية في حاوية نظام لنضح نضح الجاذبية مرة واحدة هي التي شنت الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جواني الحل : يجب أن يكون الحل بين الخلايا التي سبق وaliquoted ثم إلى 500-1000 aliquots ميكرولتر وتخزينها على -20 درجة مئوية. حل الخلايا تختلف تبعا للتجربة الحاجة ، للتسجيلات المشبك الحالي هو موضح هنا نستخدم (مم) : 125 K - غلوكونات ، 2 CaCl 2 ، 2 MgCl 2 ، 10 EGTA ، 10 HEPES ، 2 نا 2 - ATP ، 0.5 مم NaGTP الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع KOH 5. يمكن يمكن إضافة التتبع الفلورسنت مثل 10 ميكرومتر Alexafluor - 594 هيدرازيد (Invitrogen) لتصور التشعبات خلال التجربة ، وneurobiotin (0.3 ٪) أن تدرج أيضا لتحليل تشريح الخلية التالية تسجيل. عندما تكون جاهزا لتسجيل ، أذاب حل داخل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل انزيم : امزج بين 10000 وحدات كولاجيناز (المواد الكيميائية ورثينجتون) مع هيالورونيداز ملغ 83 (كيماويات رثينجتون) إلى 4.150 مل من حل خارج الخلية. متجر في 50 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية. ويمكن استخدام Aliquots لعدة أسابيع. عندما تصبح مستعدة لعلاج شبكية العين ، في تمييع قسامة 500 ميكرولتر من محلول فقاعات خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل التخزين المؤقت الفوسفات (PBS) : في 800 مل من H 2 O إضافة 8 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام من بوكل ، 1.4 غرام من الصوديوم 2 هبو 4 و 0.24 غرام من KH 2 PO 4. إحضار الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. ضبط مستوى الصوت إلى 1 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.2 العازلة الفوسفات M : في 800 مل من H 2 O إضافة 21.8 غرام من نا 2 هبو 4 و 6.4 غرام من ناه 2 ص 4. يصل حجم إلى 1 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ٪ لامتصاص العرق الحل : الحرارة 50ml H 2 O إلى 60 درجة مئوية. إضافة بارافورمالدهيد 4G ، وإثارة لعدة دقائق. إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 1M (حوالي 5 نقاط) ، والحفاظ على اثارة حتى حل واضح. إضافة 50 مل M الفوسفات 0.2 العازلة في الدورق. التحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائح الأس الهيدروجيني (~ 7.4). تصفية وباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حظر حل (10 ٪ مصل الماعز ، و 0.5 ٪ TritonX100) : في 1.8 مل من 0.2 مل PBS إضافة للمصل الماعز و 10 ميكرولتر تريتون X - 100. TritonX - 100 يعمل على permeabilise الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin الحل (5 ٪ مصل الماعز ، و 0.5 ٪ TritonX100 ، 1:500 Streptavidin 594) : في 1.9 مل من برنامج تلفزيوني إضافة 0.1 مل من مصل الماعز ، و 10 ميكرولتر تريتون X - 100 و 4 ميكرولتر من Streptavidin 594. </li></ol> 2) عزل الشبكية من الماوس أدوات تشريح المطلوبة : 1 # 2 الملقط ، 2 # 5 الملقط ، مقص العيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CO الموت ببطء الماوس وفقا لبروتوكولات وافق ، في هذه الحالة 2 اختناق واستأصل مقلة العين عن طريق إدراج بلطف زاوية مقدارها # 2 ملقط وراء العين وانتشال مقلة العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان مقلة العين في طبق بتري 35 ملم مع حل خارج الخلية. قطع العصب البصري والعضلات خارج المقلة أي مرفق أو النسيج الضام باستخدام مقص العيون. قطع القرنية مع مقص العيون وسحب العدسة باستخدام الملقط # 5. المسيل للدموع الصلبة باستخدام زوج من ملقط 5 # واستخدام ملقط لقطع العصب البصري حيث شبكية العين والصلبة يجتمع في القرص البصري. بلطف قشر شبكية العين بعيدا عن فنجان العين. نصيحة : هل كل خطوة على كل من شبكية العين قبل ان ينتقل الى الخطوة التالية للتقليل من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الملقط لإزالة الزجاجي تعلق على شبكية العين. يمكن تنفيذ ذلك من خلال &quot;الاستيلاء&quot; على زجاجي شفاف فوق الشبكية بالملقط. والزجاجي ، إذا نجحت في إزالة ، يجب أن تكون مرئية ومادة واضحة وهلامي على ملقط. نصيحة : تشريح شبكية العين في الشوط التالي لإزالة الجسم الزجاجي وزيادة كمية الأنسجة القابلة للاستخدام وجعل التركيب في غرفة أسهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على شبكية العين في حل خارج الخلية الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة مع الحد الأدنى من الإضاءة المحيطة حتى تكون جاهزة للهضم. ويمكن تخزين شبكية العين في هذا الطريق لساعات 6 ~. </li></ol> 3) علاج شبكية العين مع خليط الانزيم والمتصاعد في غرفة تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع an قسامة من كولاجيناز / هيالورونيداز في حل خارج الخلية 500 ميكرولتر ، حل مكان في صحن بيتري 35 ملم ونقل الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على شبكية العين وتحتويجي طبق بتري ، وغطت في الظلام ، في O2 95 ٪ / 5 ٪ CO 2 البيئة لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف. هذه الخطوة يساعد في هضم أي الزجاجي المتبقية ، ويتيح سهولة الوصول إلى طبقة الخلايا العقدية. نصيحة : لشبكية العين من الحيوانات الأصغر سنا أقل زجاجي أو إذا لوحظت آثار ضارة ، ويمكن تقصير الوقت لمدة 5 دقائق ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من شبكية العين تحتوي على انزيم المتوسطة وغسل نطاق واسع في حل خارج الخلية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية إلى غرفة تسجيل 6 مع طبقة مبصرة أسفل. ذبالة بعيدا السوائل المتبقية مع ماصة إما أو الأنسجة وطرح جوانب الشبكية لشد الأنسجة الحرص على اتصال فقط على حواف شبكية العين ، لا سيما تجنب الاتصال مع طبقة الخلايا العقدية. وضع خاتم البلاتين مع شبكة من النايلون على شبكية العين لترسيخ النسيج والتعبئة على الفور غرفة مع حل خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غرفة تسجيل على خشبة المسرح المجهر ، نعلق أنبوب لشفط نضح الجاذبية والفراغ ونعلق الأسلاك الارض. </li></ol> 4) الترجمة من خلايا العقدة EGFP التعبير عن الضوء والتحفيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي في شبكية العين عن طريق الجاذبية مع حل خارج الخلية بمعدلات مل / دقيقة أو أسرع 1. نصيحة : إذا كان معدل نضح بطيئة جدا ، والأنسجة لن يكون كافيا والاوكسيجين قد تعطلت إشارات متشابك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصة تسجيل مع حل داخل وأدخله حامل ماصة. نصيحة : الماصات مع المقاومة في حدود 3 إلى 5MΩ إعطاء أفضل النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور في شبكية العين تحت الحمراء البصريات تدخل الفرق (DIC) في المقابل التكبير المنخفض (الهدف 10X ، NA 0.3) لتحديد مكان تسجيل ماصة. وتستخدم الأشعة تحت الحمراء للتقليل من التعرض للضوء المرئي الشبكية والحد من التكيف مع الضوء. الانتقال الى أعلى التكبير (الهدف 40X ، NA 0.8) وتقديمهم الى القطب عرض فقط فوق الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التكبير عالية (الهدف 40X) ، مع تسليط الضوء على شبكية العين epifluorescence (480 نانومتر لEGFP) وحدد خلية العقدة الفلورسنت وعلامة على جهاز الكمبيوتر باستخدام الشريط (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مدينة دبي للإنترنت تحت الإضاءة والأشعة تحت الحمراء ، موقف القطب تسجيل بالقرب من الخلية المستهدفة العقدة (الشكل 1A). تغطي منطقة نظيفة على الفور خلية من خلال تطبيق الضغط الايجابي لطيف لتسجيل الكهربائي عبر حقنة بلاستيكية متصلة 12cc حامل ماصة مع أنابيب البولي ايثيلين. على مكبر للصوت ، أي إزاحة الصفر الجهد. القطب المكان المحدد على الخلية العقدة حتى الدمل يظهر على سطح الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مكبر للصوت في وضع المشبك الجهد ، وتطبيق نبض اختبار ومراقبة المارة الحالي من خلال ماصة. الضغط السلبي لإنشاء ختم بين القطب والخلية. الافراج عن الضغط السلبي عندما تبدأ الخلية لختم والانتظار حتى عقد الراهنة تعد مؤشرا لابرام الكهربائية GΩ بين غشاء الخلية وماصة. نبضات من تطبيق لطيف الضغط السلبي حتى العابرين بالسعة تظهر ثم الإفراج عن أي تطبيق الضغط. نصيحة : إذا كان وصول (سلسلة) مقاومة عالية (&gt; 30MΩ) ، وغالبا ما يكون ذلك عن طريق تحسينها إضافية ، والبقول ، لطيف جدا من الضغط السلبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم التوصل إلى ختم مستقرة تطبيق نبضة من الضغط السلبي. بعد الحصول على وضع كامل الخلية ، والسماح للتكيف مع خلية مظلمة لمدة 5 دقائق. سجل ، في الاستجابة الحالية المشبك ، ووضع لكامل الحقل ، والتحفيز الضوء الأبيض (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التسجيل ، وسوف Alexafluor - 594 قد تنتشر إلى التشعبات. يمكن أن يكون التتبع في إطار تصور epifluorescence في 594 نانومتر ، ويستخدم لتحديد ما إذا كانت خلية العقدة معطلة ، خارج ، أو ثنائية طبقية عن طريق التبديل بين البصريات الأشعة تحت الحمراء ومدينة دبي للإنترنت epifluorescence 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تضمين neurobiotin ماصة في شبكية العين وسوف تتم معالجتها لالمناعية ، ثم يجب أن تكون ماصة تراجع بلطف لتوفير الحد الأدنى من اضطراب الغشاء. </li></ol> 5) تحليل تشريح خلايا العقدة المسجلة ملء مع neurobiotin يسمح للمزيد من التحليل الصرفي مفصلة للخلايا العقدة التالية تسجيل. نصيحة : إذا كانت هناك رغبة الارتباطات المحددة بين خلية ومورفولوجيا العقدة سجلت تفصيلا ، فإنه قد يكون من الأفضل لتسجيل وملء واحدة فقط RGC في التحضير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تضمين neurobiotin في حل الخلايا الشبكية ثم ضع في حل بارافورمالدهيد والإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في برنامج تلفزيوني ، على الأقل 2 ساعة ، لا يقل عن 6 تغييرات. نقل إلى لوحة شبكية العين تحتوي على حل حظر. إجازة في عرقلة الحل لمدة 2 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال حل حجب مع الحل Streptavidin. احتضان 2 يوما في 4 درجات مئوية على شاكر. شطف شبكية العين في برنامج تلفزيوني ، يشطف 6 ، 20 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب شبكية العين مع Vectashield في شريحة زجاجية.يجب أن توضع في الشبكية مع خلايا العقدة حتى. إجراء الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1C). </li></ol> ممثل النتائج إذا الشبكية سليمة وتشريح كان ناجحا ، يجب أن يكون الفرد خلايا العقدة مرئية تحت التكبير في مدينة دبي للإنترنت عالية (الشكل 1A). وشبكية العين وغير صحية كبيرة ، نوى حبيبات ، وينبغي أن يكون التخلص منها. وإذا كانت الاستجابة متشابك من خلية العقدة نظرا سليمة ، ومن ثم ينبغي الخلية الرد في ضوء ظهور أو الإزاحة مع إمكانات العمل ، وفي حالة وجود خلايا العقدة في جوهرها ، حساس (1B الشكل) ، والاستقطاب المستمر. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التوطين ، وتسجيل ، وتلطيخ لخلية العقدة الشبكية fluorescently المسمى : (أ) تصور GFP RGC الايجابية في ظل الإضاءة epifluorescent في التكبير 40X (اللوحة اليسرى) وتحت إنارة مدينة دبي للإنترنت (اللوحة اليمنى). (ب) الاستجابة للضوء متشابك من M2 حساس جوهريا خلية العقدة الشبكية المسجلة في خلية كاملة النمط الحالي من المشبك RGC fluorescently المسمى. (C) M1 حساس جوهريا خلية العقدة الشبكية التي تم تحديدها تحت epifluorescence ، تستهدف خلية كاملة من التسجيل ، مليئة neurobiotin ، ومعالجتها بعد ذلك لالمناعية.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

هذه التقنية قابلة للتطبيق على أي تسجيلات العقدة خلايا شبكية من شبكية العين معزولة. وإن كان في خط الماوس المستخدمة أعلاه حساس في جوهرها ، معربا عن melanopsin - RGCs وصفت مع EGFP 2 ، 5 ، هذا البروتوكول غير قابل للنقل بسهولة إلى خطوط أخرى RGC fluorescently المسمى أو يمكن تعميمها على س?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

الخطوات الأولى في الرؤية الفقارية تأخذ مكان عند الضوء يحفز المستقبلات الضوئية قضيب ومخروط في شبكية العين 1. ثم يتم فصل هذه المعلومات في ما يعرف المسارات وإيقاف تشغيله. المعلومات مبصرات إشارة الضوء على الخلايا القطبين (BCS) ، والذي يزيل الاستقطاب استجابة للزيادات (في BCS) أو النقصان (إيقاف BCS) في شدة الضوء. هو الحفاظ على هذا الفصل من المعلومات الضوء على مستوى الخلايا الشبكية العقدة (RGCs) ، والتي التشعبات تقسيمها في sublamina إما الخروج من طبقة ضفيري الداخلية (IPL) ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من BCS معطلة ، أو تقسيمها في في يوم من sublamina IPL ، حيث يتلقون مدخلات استثارية مباشرة من على BCS. هذا الفصل هو الحفاظ على معلومات بشأن الزيادة أو النقصان في الإضاءة (وعلى الممرات وخارج) ، وأشار إلى الدماغ بشكل متواز. وRGCs هي الخلايا الناتج من شبكية العين ، وبالتالي فهي خلية هامة لدراسة من أجل فهم الكيفية التي اشارت المعلومات الضوء على نواة البصرية في الدماغ. وقد أدت التطورات في مجال علم الوراثة الماوس على مدى العقود الأخيرة في مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل فلوري حيث وصفت السكان RGC محددة مع بروتين فلوري للسماح لتحديد الأنواع الفرعية RGC 2 3 4 ومحددة تستهدف لتسجيل الكهربية. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لتسجيل ردود الضوء من خلايا العقدة fluorescently المسمى في إعداد سليمة ، الشبكية معزولة. هذا التحضير معزولة الشبكية يسمح للتسجيلات RGCs من حيث جذع شجيري سليمة والحفاظ على المدخلات عبر جذع شجيري RGC بأكمله. هذا الأسلوب هو المعمول عبر مجموعة متنوعة من أنماط فرعية خلية العقدة ، وهي قابلة للطائفة واسعة من التقنيات وحيدة الخلية الفيزيولوجي.

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  University of Minnesota. هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.

Video: An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

وسحق العصب البصري النموذجي إصابة الفئران لدراسة الخلايا الشبكية بقاء العقدة

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

عزل شبكية الفأر وعلاج الميثانول لدراسة خلايا العقدة الشبكية

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

تسليط الضوء على المؤلف: إعداد كامل التركيب قائم على الميثانول للتحقيق في خلايا العقدة الشبكية  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...