Este trabajo fue financiado por la investigación para prevenir la ceguera y los Institutos Nacionales de Salud de subvención EY10542.

1. Rebanadas de retina Preparación <ol><li> Monte la cámara (diseño ilustrado en la Figura 1). Se colocan dos gotas de grasa de vacío, espaciados ~ 8-10 mm aparte, a través de la cámara de grabación para formar un canal para superfusate y en el que se incorporará las rodajas de la retina. Añadir una segunda gota de grasa de unos pocos milímetros más lejos hacia fuera más allá de cada uno de estos dos gotas de grasa para actuar como un dique y el límite de desbordamiento. Colocar una pequeña pieza triangular de KIMWIPE en el extremo de la cámara para asegurar el contacto de fluido con el electrodo de referencia. </li><li> Pulse una pieza de membrana de nitrocelulosa (~ 5 x 10 mm; 0,8 poros micras) plana contra el portaobjetos de vidrio en dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Evitar poner grasa directamente debajo del centro de la membrana de nitrocelulosa, ya que esto puede evitar que se adhiera la retina. </li><li> Para preparar la máquina de cortar el tejido, romper una hoja de afeitar de doble filo en 4 trozos y coloque uno en el brazo de corte. Corte una rebanada delgada de nitrocellulmembrana ose para asegurar que el borde de corte de la cuchilla de afeitar quede plana contra la cámara de registro y por lo tanto corta limpiamente a través de la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Mantenga un pequeño vaso de precipitados de solución salina anfibio (Tabla 1) en el hielo en la estación de disección. </li><li> La eutanasia salamandra por decapitación. Hemisect sagital de la cabeza y la médula a través de la médula espinal. Coloque la mitad de la cabeza en un trozo de algodón humedecido con solución salina anfibio sobre un bloque de linóleo. La otra mitad de la cabeza puede ser envuelto con una toalla de papel húmeda y se almacenó a 4 ° C para su uso posterior en el día. </li><li> Enucleación del ojo. Usando Vannas pequeñas tijeras, cortar la piel que conecta el ojo con la órbita alrededor. Después de la liberación de la parte frontal del ojo a partir del tejido circundante orbital, tire el ojo hacia afuera y deslice las tijeras bajo el ojo para cortar a través de los músculos del ojo y del nervio óptico, liberando el ojo de la órbita. </li><li> Coloque el ojo enucleado en una cama de algodón en elbloque de linóleo. Deseche la mitad de la cabeza. Quite la grasa orbital superior de la parte posterior del ojo. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el centro de la córnea con una cuchilla quirúrgica agudo. Retire la córnea por deslizamiento Vannas tijeras finas en la incisión y se extiende el corte radialmente hacia fuera hacia la ora serrata. Cortar circunferencialmente alrededor de la ora serrata mediante la rotación del bloque de linóleo o el algodón entre los cortes. </li><li> Después de cortar todo el camino alrededor de los ojos, eliminar la córnea y la lente tirando de ellos fuera del lado de la ojera. Mueva el ocular resultante sobre una superficie dura del bloque de linóleo humedecido con solución salina anfibio. Cortar en tres partes con una hoja de afeitar afilada, con un movimiento de sierra fina para asegurar que haya cortado todo el camino a través de la esclerótica. </li><li> Coloque una o dos piezas de ocular en la membrana de nitrocelulosa con la superficie de la retina hacia abajo. Sumerja las piezas restantes con solución salina adicional y colocarlos en el refrigerador a 4 ° C. ~ </li><li> Gently presione la pieza de ocular contra la membrana de nitrocelulosa con unas pinzas finas. Sumergir la membrana de nitrocelulosa y la pieza ocular con varias gotas de solución salina fría y anfibios blot en los bordes con KIMWIPE para ayudar a la retina a que se adhieran. Una vez más, sumergir la copa ocular y la membrana de nitrocelulosa con varias gotas de solución salina anfibio frío y se desprenden de la esclerótica / coroides / epitelio pigmentario de la retina para aislar la retina (que puede aparecer de color rosa debido a la presencia de la rodopsina sin blanquear). Si es necesario, cortar el nervio óptico para liberar la retina. </li><li> Si la retina no está conforme con fuerza, drenar la solución salina con una KIMWIPE para tirar de la retina más firmemente hacia abajo sobre la membrana de nitrocelulosa. Reemplace la solución salina. Repetir, si es necesario. </li><li> Llenar la cámara con solución salina anfibio frío y la transferencia a la etapa de la máquina de cortar tejido. Cortar la retina y la membrana de nitrocelulosa en tiras finas, de trabajo de un extremo al otro girando el micrómetro a vernieren incrementos de 125 m. Presione la hoja de afeitar suavemente pero con firmeza a través de la retina y la membrana de nitrocelulosa. </li><li> Transfiera las rebanadas de retina moviendo tiras de membrana de nitrocelulosa para el canal principal de la cámara de grabación. Levante una tira de membrana de forma gratuita y luego mantenerlo en su lugar mientras se mueve la cámara por debajo de él, asegurándose de mantener los cortes sumergidos. Insertar los bordes de la membrana de nitrocelulosa en las tiras de grasa de vacío, girarlos 90 grados para acceder a las capas de la retina. </li><li> Pulse la membrana de nitrocelulosa plana contra la superficie del vidrio. Incluso si no hay retina en cada pieza, colocar tiras de membrana de nitrocelulosa a intervalos regulares (~ 1 mm de diferencia) a lo largo de toda la longitud del canal de perfusión para ayudar a romper la tensión superficial y mejorar el flujo de fluido. </li></ol> 2. Pares de células enteras grabaciones <ol><li> Después de todas las rebanadas se han transferido, mover la cámara de registro a la etapa de una posición vertical, fijomicroscopio de fase y conecte el cable del electrodo de referencia. Se centran en las rebanadas con una distancia larga de trabajo, inmersión en agua, 40-60X objetivo. El microscopio debe ser colocado sobre una mesa de aire para amortiguar las vibraciones y encerrado en una jaula de Faraday para reducir la interferencia eléctrica. </li><li> Superfuse las rebanadas continuamente a una velocidad de 1 ml / min con solución salina anfibio burbujeado con 100% de O 2. Conectar la aspiración, asegurándose de que la entrada y salida están equilibrados. Caudal de salida se puede regular girando el extremo biselado de la aguja de aspiración o moviendo el KIMWIPE en el extremo de la cámara más cerca o más lejos de la aguja de flujo de salida. La preparación puede conservarse a temperatura ambiente o se enfría con un dispositivo Peltier o, simplemente definiendo un paquete de hielo en la platina del microscopio. </li><li> Examine las rebanadas con poca luz o infrarrojos e identificar un par de células - un fotorreceptor (varilla o cono) y células horizontales o bipolar cerca - a la meta para la grabación de células enteras. Rods pueden ser identified por sus cuerpos celulares grandes y varilla-como los segmentos externos de prominentes (Figura 2A). Los conos son más pequeñas que las barras y tienen pequeños segmentos exteriores cónicas. Célula bipolar y somas celulares horizontales están en la fila más exterior de los cuerpos celulares en la capa nuclear interna (INL; Figuras 2B y 2C). </li><li> Antes de preparar las rebanadas, utilizar un extractor de pipeta para la fabricación de pipetas de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,2 mm, 0,95 mm de diámetro interior con un filamento de vidrio). La punta de cada micropipeta debe ser ~ 1-2 micras de diámetro. </li><li> Usando una aguja de relleno no metálico (por ejemplo, uno fabricado a partir de una jeringa de 1 cc o un Microfil), llenar pipetas con la solución intracelular (Tabla 1) y se unen a el soporte del electrodo. </li><li> Eleve el objetivo del microscopio ligeramente. Coloque la pipeta fotorreceptor debajo del objetivo y luego bajar de modo que la punta se coloca justo por encima de las rebanadas. Repita con tlo segundo pipeta. </li><li> Ajuste cualquier desplazamiento en el actual nivel de referencia en el amplificador. Comprobar la resistencia de pipeta con un 5-10 mV pulso despolarizante. Por lo general utilizan pipetas que van desde 10 hasta 15 mW, el resultado de la larga conicidad de la baja osmolaridad de las soluciones de eje de pipeta y anfibios. Con las soluciones de osmolaridad mamíferos superiores, estas mismas pipetas presentan valores de resistencia de ~ 8-12 mW. Si bien hemos utilizado diámetros de punta más grandes con valores de resistencia de 3-4 mW en soluciones de anfibios, las ventajas proporcionadas por una resistencia inferior de acceso se compensan con una mayor dificultad en el sellado en las membranas celulares y una más rápida resumen de las corrientes de calcio y otros segundos mensajeros sensibles a las respuestas. </li><li> Mientras aplica presión leve, posición positiva la pipeta post-sináptica de manera que hace contacto con el cuerpo celular horizontal o bipolar. A continuación, coloque la pipeta presináptica de manera que entra en contacto con el cuerpo de la célula de un fotorreceptor varilla o cono. Grabaciones appear a ser más estable cuando las puntas de pipeta en contacto con el segmento interno en lugar de el soma, especialmente en los conos. </li><li> Mientras que el control de la resistencia, liberar la presión positiva en la pipeta post-sináptica. A veces, la liberación de la presión positiva es suficiente para formar un sello gigaohmio. Si no es así, aplicar succión suave con una jeringa de 1 ml o por vía oral. Después de la resistencia punta ha crecido hasta&gt; 100 M, aplicar un potencial de mantenimiento de -60 mV. Después de obtener un sello gigaohmio, nulo a cualquier transitorio capacitancia pipeta y repita el procedimiento de sellado para el fotorreceptor pipeta, la aplicación de un potencial de mantenimiento de -70 mV. </li><li> La rotura del parche con la boca o una jeringa para aplicar succión a cada célula a su vez. Rods, conos y células bipolares se suelen romper con una suave succión. Obtención de configuración de célula con una célula horizontal puede requerir una mayor succión (es decir, con una jeringa de 3 cc) en combinación con fuertes pulsos de voltaje rápidos entregados con el f &quot;zap&quot;eature del amplificador de patch clamp. La rotura de la membrana y el establecimiento de la configuración de célula completa será evidente por la aparición de los transitorios de capacitancia de células enteras. </li><li> Confirmar la identidad de la célula post-sináptica fisiológicamente mediante la aplicación de un destello de luz y la entrega de una serie de pasos de voltaje de -120 a 40 mV en incrementos de 20 mV (Figuras 3 y 4). </li><li> Para evaluar si el par de células están conectadas sinápticamente, entregar un breve (25-100 ms), 60 mV paso despolarización del fotorreceptor (a -10 mV, cerca del pico de la corriente de calcio tipo L dependientes de voltaje) y mirar para las corrientes post-sinápticas en la segunda neurona orden (Figura 5). Un fuerte paso despolarizante debe evocar una, transitorios de corriente hacia el interior de post-sináptica rápida en la celda horizontal o APAGADO post-sináptica bipolar causado por una explosión de liberación de vesículas desde el cono (Figura 5). </li></ol>

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B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La preparación rebanada retina ha demostrado ser muy útil para el análisis de los circuitos y mecanismos empleados por la retina para procesar la información visual. La capacidad de obtener grabaciones de células enteras simultáneamente de las neuronas pre y post-sináptica ha sido particularmente útil en esta tarea. Grabaciones de células enteras apareadas son mucho más fácil de lograr con las rebanadas que con-montaje plana preparaciones de retina debido a que las diferentes capas de la retina están expuestas. Por otra parte, debido a sus grandes neuronas de la retina, salamandras tienen una larga historia como una preparación de retina, por lo que proporcionan un sistema modelo particularmente bien caracterizados. Con la práctica, rodajas saludables de salamandra retina se pueden preparar con regularidad. A pocos pasos clave pueden hacer la diferencia entre el éxito y el fracaso. 1) Asegúrese de que la cuchilla se monta en la máquina de cortar el tejido para que quede plana contra la superficie del vidrio y rebanadas limpiamente aunque tanto el tejido y underlyimembrana de nitrocelulosa ng. Si has hecho un corte limpio a través de la membrana de nitrocelulosa, usted debe oír un ligero clic cuando la cuchilla golpea la superficie de la lámina de vidrio. 2) Asegúrese de que la retina se ha adherido a la membrana de nitrocelulosa. De lo contrario, la retina puede flotar fuera de la membrana durante cualquier etapa de los procedimientos. 3) No exponga las rebanadas cortadas al aire, ya que esto puede dañar muchas de las células superficiales. 4) Asegúrese de que las rebanadas y la membrana de nitrocelulosa se acueste contra el portaobjetos de vidrio para que las capas de la retina se observan bajo el microscopio de disección. 5) Equilibrar las tasas de flujo de entrada y flujo de salida superfusate con el fin de evitar que desborda la cámara de grabación. Esto evita que los cambios repentinos en los niveles de solución, que puede causar movimientos bruscos del tejido. 6) Seleccionar un par saludable de las células cercanas el uno al otro. Las células con citoplasma suave son más saludables que las células con citoplasma granular. Las células más profundas en el corte son más propensos a retener con sináptica intactacontactos. 7) Asegúrese de que la punta de la pipeta no se ha roto o rozado otro tejido o escombros en el camino a las células. 8) Compruebe la resistencia pipeta para asegurarse de que no está obstruido con suciedad o una burbuja, los cuales pueden hacer que sea difícil obtener una grabación de células enteras de calidad. En lugar de fijación de la retina a papel de filtro de nitrocelulosa, algunos investigadores incrustar retinas en un bloque de agar y utilizan un vibratomo para cortar rodajas de la retina. Aunque no hemos probado este enfoque, Kim et al. 11 de discutir las ventajas de ambos enfoques. En su experiencia, el enfoque basado en agar proporciona un rendimiento más consistente de las rebanadas planas con capas retinianas bien delineados pero el enfoque del filtro basado en papel produce fotorreceptores sanos. Los conos y bastones son responsables de la transducción de la luz en los cambios en el potencial de membrana. Con grabaciones emparejados, el potencial de membrana de varillas o conos puede ser MANIPULATED directamente y por lo tanto la capacidad de generar respuestas de la luz, si bien es útil para la identificación de tipos de células, puede no ser esencial. Por lo tanto, a menudo preparamos rodajas de luz blanca. Sin embargo, incluso si se prepara bajo una iluminación brillante, neuronas de la retina salamandra pueden generar grandes respuestas de la luz como se ilustra por las respuestas en la figura. 3. Esto es en parte debido a la relativamente gran reserva de cromóforo en el gran volumen segmento externo, pero también puede reflejar la capacidad de las células de Müller para regenerar 11-cis-retinal a los conos de 12. Para obtener respuestas de la luz totalmente adaptados a la oscuridad, se pueden preparar los rebanadas bajo iluminación infrarroja. Para las disecciones bajo luz infrarroja, concedemos GenIII intensificadores de imagen (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para los oculares del microscopio de disección e iluminar el tejido con una linterna LED infrarrojo. Para cortar y otros procedimientos que se lleven a cabo bajo el microscopio de disección, se emplea una ima montado en la cabezaintensificador ge. Para la colocación de las pipetas de parche, visualizamos rebanadas utilizando una cámara CCD sensible a infrarrojos (por ejemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, Nueva York) montado en la posición vertical, microscopio-fase fija. Con estas precauciones, se pueden obtener respuestas barras expositoras sensibilidad única de fotones 6, 13. Una de las limitaciones de trabajar en rebanadas de retina es que los procesos celulares largo de grandes neuronas retinianas de campo pueden perder muchos de sus dendritas durante el proceso de corte. Rebanada preparativos retina son por lo tanto más útil para el estudio de la fisiología de las células en las que los contactos sinápticos implican procesos cerca del cuerpo celular. Retinas de anfibios y mamíferos comparten muchos de los mismos tipos de células, y utilizan mecanismos fisiológicos similares 14-16. Mientras salamandra retina es un buen modelo para muchos aspectos de la retina de mamíferos, una diferencia importante parece ser la presencia de una vía de varilla dedicado en mamíferos que invoIves contactos de células especializadas barra bipolares en las células amacrinas AII 14. Una limitación adicional de la retina salamandra es el pequeño número de herramientas genéticas desarrolladas específicamente para esta especie. Sin embargo, los anticuerpos y reactivos shRNA que se dirigen a regiones bien conservadas en otras especies pueden ser utilizados con éxito en la salamandra, al igual que muchos inhibidores de moléculas pequeñas y reactivos peptídicos. Además, con algunas modificaciones en la técnica, las rebanadas de retina se pueden preparar a partir de otras especies en las que algunas de estas herramientas son más fáciles de obtener. Más allá de su utilidad para emparejado células enteras de grabación, la preparación rebanada retina salamandra también es susceptible a una variedad de otros enfoques. Como se discutió anteriormente, las rebanadas de retina se pueden utilizar para estudiar respuestas de la luz en combinación con diferentes protocolos de fijación de voltaje 17. Neuronas de la retina también se pueden cargar con colorantes fluorescentes sensibles a Ca 2 +, Cl -, o Na+ Introducida a través de la pipeta de parche o de baño-aplicación 15,18-20. Un péptido fluorescente que se une a la cinta sináptica 21 puede ser introducido a través de la pipeta de parche y se utiliza para obtener imágenes de la cinta 10 o, cuando se conjugan con fluoresceína, de forma aguda y dañar selectivamente la cinta 22. También hemos utilizado rebanadas de retina en combinación con los puntos cuánticos para vigilar los movimientos de los canales de calcio individuales en la barra y cono terminales sinápticos 23. Por lo tanto, la rebanada de la retina vertical es una preparación experimental versátil para el estudio de mecanismos sinápticos básicas y las funciones de procesamiento únicas realizadas en la primera sinapsis en la vía de señalización visual.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

Una de las tareas centrales de la neurociencia retina es entender los circuitos de neuronas de la retina y cómo esas conexiones son responsables de la formación de las señales transmitidas al cerebro. Los fotones se detectan en la retina por conos y bastones fotorreceptores, que convierten esa energía en una señal eléctrica, la transmisión a otras neuronas de la retina, donde se procesa y se comunica a los objetivos centrales en el cerebro a través del nervio óptico. Importantes primeros conocimientos sobre circuitos de retina y el procesamiento visual vinieron de los estudios histológicos de 1,2 Cajal y, más tarde, a partir de los registros electrofisiológicos de la actividad adición de células ganglionares de la retina - las células de salida de la retina 3,4. Una comprensión detallada de procesamiento visual en la retina requiere una comprensión de la señalización en cada paso en la vía de fotorreceptores a células ganglionares de la retina. Sin embargo, muchos tipos de células retinianas son fresaied profunda en el tejido y por lo tanto relativamente inaccesible para el registro electrofisiológico. Esta limitación se puede superar mediante el trabajo con las rebanadas verticales, en el que las células que residen dentro de cada una de las capas de la retina son claramente visible y accesible para el registro electrofisiológico. Aquí se describe un método para la fabricación de secciones verticales de retinas de larvas salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Mientras que esta preparación fue desarrollado originalmente para grabaciones con microelectrodos afilados 5,6, se describe un método para grabaciones de doble fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden en el que manipulamos potencial de membrana del fotorreceptor durante la grabación simultánea de post- las respuestas sinápticas en células horizontales o bipolar. Los fotorreceptores de la salamandra tigre son considerablemente más grandes que los de las especies de mamíferos, haciendo de ésta una preparación ideal en el que para llevar a cabo tsu enfoque experimental técnicamente difícil. Estos experimentos se describen con miras a sondear las propiedades de señalización de la cinta sináptica - una estructura sináptica especializada que se encuentra en un sólo un puñado de neuronas, incluyendo bastones y conos fotorreceptores, que es muy adecuado para el mantenimiento de una alta tasa de liberación de neurotransmisores tonic 7 , 8 - y cómo contribuye a las propiedades únicas de señalización de esta primera sinapsis retina.

Rastros representativos de respuestas de la luz de las neuronas en rodajas verticales de salamandra retina se muestran en la Figura 3. El cono, célula horizontal, y OFF células bipolares todas muestran una corriente hacia el exterior en respuesta a la aparición de la luz. El destacado corriente de entrada después de la luz del flash en las grabaciones de células horizontales y bipolar es causado por el aumento de la liberación de glutamato de los fotorreceptores como despolarizan en el desplazamiento de luz. El EN célula bipolar responde con una corriente de entrada al inicio de la luz como resultado de una metabotrópicos signo inversora receptor de glutamato cascada de señalización y activación de TRPM1 canales 9. Células horizontales y células bipolares se pueden distinguir una de otra por su relaciones IV (Figura 4). Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada lineal o dentro rectificar IV y bajo (&lt;500 mW; Figura 4A) mientras que las células bipolares tienen una alta resistencia de entrada(0,5-2 GΩ) y hacia el exterior-rectificar I - V (Figura 4B) Figura 5 muestra resultados representativos de grabaciones de un par de células de cono horizontal (Figura 5A) y el par de células bipolares cono-apagado (Figura 5B).. En cada uno, el cono despolarizante a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV evocó una corriente en el cono y la EPSC rápida hacia el interior en la celda horizontal o bipolar de calcio dependiente de voltaje. Esta fuerte estímulo es suficiente para vaciar la piscina fácilmente liberable de vesículas ~ 20 de cada cinta sináptica, lo que resulta en una EPSC de ~ 47 pA / de la cinta 10. El EPSC celular horizontal en la Figura 5A fue de 232 pA, lo que sugiere que recibió 5 contactos planos de la cono presináptica. Una estimación similar del 178 pA EPSC en la célula bipolar off (Figura 5B) sugiere que recibió 4 contactos planos del cono presináptica. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfibios salina </td><td> Pipeta presináptica </td><td> Pipeta Postsináptica </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamato * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Cloruro de tetraetilamonio </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mM </td><td> 9 mM </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolaridad **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamato se hace mediante la neutralización mM de ácido L-glutámico 40 con 40 mM de CsOH en la solución de la pipeta. ** Una de stock 1 M de Cs-gluconato se hace mediante la neutralización de una solución de CsOH con ácido D-glucónico 45-50%. *** El pH debe ser ajustado con NaOH para la solución extracelular y CsOH para las soluciones de pipeta. **** Mantener la osmolaridad de las soluciones de pipeta justo por debajo de la de la solución extracelular impide la hinchazón celular y mejora la longevidad de la grabación. Tabla1. Componentes y parámetros para las soluciones intracelulares y extracelulares estándar utilizados en este protocolo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Diseño de la cámara de grabación. (AC) Arriba, al lado, y las vistas de corte de la cámara de registro que muestra las dimensiones. La cámara está fabricada en una pieza de espesor 2 mm de acrílico. (D) cámara de ensamblado. Superfusate entra en la cámara a través de una longitud de 10 cm de un tubo de Teflón (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate se elimina mediante la aplicación de succión leve a un tubo de metal de calibre 20 biselado en el otro lado de la cámara. Adyacente a este tubo de salida es un electrodo de referencia de pellets de Ag / AgCl. La ventaja de este electrodo de referencia está conectado a la entrada de referencia de la headstage. Un pequeño triángulo de KIMWIPEse coloca sobre el electrodo de referencia para mantenerla en contacto con la solución y regular el flujo de la solución en el tubo de flujo de salida. La base de la cámara se forma mediante la colocación de un portaobjetos de microscopio de vidrio en los bordes hendidos de la cámara. La presentación se celebró en el lugar con una gota de grasa de vacío. Las tiras de membrana de nitrocelulosa con rodajas de la retina están incrustados en las gotas de grasa de vacío que forman un canal para la solución de flujo. Antes de hacer las rebanadas, un x 10 mm trozo de membrana de nitrocelulosa 5 se fija a la cámara con dos pequeñas gotas de grasa de vacío. Un pedazo de la ojera se coloca lado vítreo abajo en esta membrana de nitrocelulosa y se levanta lejos una vez que se adhiere la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Parejas de células llenas de tinte en verebanada preparación rtical. A) Imágenes de una barra y células horizontal sinápticamente de acoplamiento que se llena de contraste tintes fluorescentes introducidas a través de la pipeta parche durante la grabación simultánea de células enteras. Lucifer amarillo (2 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta varilla (amarillo) y sulfarhodamine B (1 mg / ml) se incluyó en la solución de la pipeta celular horizontal (púrpura). Fluorescente imágenes fueron capturados utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado con una cámara CCD enfriada (Orca ER) y montado en el microscopio de platina fija (Nikon E600 FN con 60X, 1,0 NA objetivo de inmersión en agua). Estas imágenes fueron superpuestas sobre las imágenes de campo claro de las rebanadas de retina correspondientes usando Adobe Photoshop. B) Imágenes de un cono y sinápticamente acoplados APAGADO célula bipolar. El axón terminal celular bipolar se ramifica en el sublamina exterior (S1) de la capa plexiforme interna cerca de la frontera con la capa nuclear interna. <strong&gt; C) Las imágenes de un cono y celular horizontal sinápticamente de acoplamiento. Tenga en cuenta que los terminales de cono son considerablemente más grande que el terminal del axón de la varilla. Aunque las células horizontales se pueden identificar por la forma oblonga de sus cuerpos celulares, los cuerpos celulares de la EN-y las células bipolares de tipo APAGADO en la INL no pueden distinguirse fácilmente antes de la grabación. Sin embargo, uno puede apuntar desplazados cono expulsados ​​de las células bipolares que tienen los cuerpos celulares de las ONL y se pueden distinguir de los conos por la ausencia de segmentos internos y externos. La barra de escala es de 20 micras. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Corrientes registradas bajo la abrazadera de voltaje de cuatro neuronas retinianas diferentes en respuesta a una brillante 500 ms destello de luz blanca de luz evoca. El cono (A), células horizontales <strong&gt; (B), y fuera de la célula bipolar (C) todos respondieron a la luz con una corriente hacia el exterior. (D) en la celda bipolar responde a los mismos estímulos de luz con una corriente hacia el interior. El ruido de la línea de base expuesta por la célula bipolar off (C) refleja una liberación continua de las vesículas sinápticas en la oscuridad que disminuye cuando los fotorreceptores hiperpolarizan a la luz. Se obtuvieron respuestas de estos cuatro celdas en las grabaciones separadas utilizando rebanadas preparadas con luz blanca. La intensidad del estímulo luminoso blanco utilizado en estos ejemplos produjo respuestas en las células bipolares y horizontales equivalentes a 580 nm flujo de fotones de 1 x 10 5 fotones / seg / 2 micras. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> La Figura 4. Relaciones corriente-voltaje (IV) de hcélulas bipolares orizontal y apagado. (A) Panel superior, corrientes de membrana evocadas por una serie de voltaje 150 mseg -120 a 40 mV aplicado en incrementos de 20 mV (panel inferior) a una célula horizontal. Células horizontales tienen típicamente una resistencia de entrada baja y relaciones lineales o dentro rectificar IV. (B) relación IV de una célula bipolar fuera en respuesta a una serie de pasos de voltaje. Células bipolares tienen una mayor resistencia de entrada y un IV de rectificación hacia el exterior, debido a la activación de las corrientes de potasio dependientes de voltaje. <img alt="La figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplos de registro de datos apareados. (A) Registro de la corriente de calcio dependientes de voltaje de cono (Cono I Ca </sub&gt;) en respuesta a una mseg paso 100 a -10 mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV (Cono V m). De fugas y la capacitancia transitorios fueron restados utilizando un protocolo de sustracción de fugas P / 8. Una rápida corriente excitatoria post-sináptica (EPSC; HC PSC) se registró de forma simultánea desde una célula horizontal, que muestra que estos dos células están acoplados sinápticamente (B) Un EPSC se registró en una célula bipolar fuera en respuesta al mismo estímulo en otro. cono.

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Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Y explicamos cómo usamos estos sectores para estudiar la actividad sináptica de la retina mediante la obtención de dos grabaciones de fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden.

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K vistas.  University of Nebraska Medical Center. Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre ( Ambystoma tigrinum) Y explicamos cómo usamos estos sectores para estudiar la actividad sináptica de la retina mediante la obtención de dos grabaciones de fijación de voltaje de células enteras de fotorreceptores y células horizontales y bipolares de segundo orden.

Video: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...