עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. אנו מודים דרווין חכה לקבלת סיוע טכני שלו.

שימוש הצהרת בעלי חיים: בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות שתוארו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, תוך שימוש בפרוטוקולים אושרה על ידי אוניברסיטת מינסוטה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש. 1) הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע הקלטה אלקטרו, פתרונות תאיים, תאית, ואת האנזים צריכים להיות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים: האחד לערבב בבקבוק (8.8g) של המדיום אבקת &quot;איימס (סיגמא) עם l 1 של H 2 O ו - 1.9 גרם של סודיום ביקרבונט (23 mM). בנקודות כל פתרון תאיים רווי 95% O 2 / 5% 2 CO בתערובת הגזים. העברת 200 מ&quot;ל כדי מבחנה לאחסון הרשתית. מניחים את הפתרון הנותרים במיכל זלוף מערכת זלוף הכבידה פעם הוא רכוב הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאיים פתרון: פתרון תאיים צריך נעשו בעבר aliquoted מכן לתוך 500-1000 aliquots μL ומאוחסנים ב -20 ° C. פתרון תאיים משתנה בהתאם הניסוי הצורך, עבור הקלטות מהדק הנוכחי המוצג כאן אנו משתמשים (מ&quot;מ): 125-K-gluconate, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0.5 mM NaGTP עד 7.2 pH עם KOH 5. נותב ניאון כגון 10 מיקרומטר Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) ניתן להוסיף לדמיין דנדריטים במהלך הניסוי, ואת neurobiotin (0.3%) יכול להיכלל גם לניתוח של האנטומיה תא הבאים ההקלטה. כאשר מוכן להקליט, הפשרה פתרון תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון אנזימים: שילוב 10,000 יחידות collagenase (כימיקלים וורטינגטון) עם Hyaluronidase מ&quot;ג 83 (כימיקלים וורטינגטון) לתוך 4.150 מ&quot;ל של תמיסת תאי. חנות ב 50 aliquots μL ב -20 ° C. Aliquots יכול לשמש למשך מספר שבועות. כאשר מוכן לטפל ברשתית, לדלל aliquot לתוך μL 500 של פתרון תאיים מבעבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו פתרון (PBS): ב 800 מ&quot;ל של H 2 O להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.4 גרם של Na 2 HPO 4 ו - 0.24 גרם של KH 2 PO 4. תביאו את ה-pH ל -7.4 עם NaOH. כוון את עוצמת הקול עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר פוספט 0.2 M: ב 800 מ&quot;ל של H 2 O להוסיף 21.8 גרם של Na 2 HPO 4 ו - 6.4 גרם של לאא 2 PO 4. תביאו נפח 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde פתרון 4%: מחממים 50 מ&quot;ל H 2 O עד 60 ° C. הוסף paraformaldehyde 4G, מערבבים במשך כמה דקות. הוסף כמה טיפות של NaOH 1M (כ 5 טיפות), לבחוש עד פתרון ברור. הוסף 50 מ&quot;ל 0.2 M חיץ פוספט לתוך כוס. בדוק pH בעזרת רצועות ה-pH (~ 7.4). סינון מגניב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חסימת (נסיוב עיזים 10%, 0.5% TritonX100): ב 1.8 מ&quot;ל של PBS להוסיף 0.2 מ&quot;ל של סרום עיזים 10 μL טריטון X-100. TritonX-100 משמש permeabilise הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streptavidin פתרון (נסיוב עיזים 5%, 0.5% TritonX100, 1:500 streptavidin 594): ב 1.9 מ&quot;ל של PBS להוסיף 0.1 מ&quot;ל של סרום עז, 10 μL טריטון X-100 ו - 4 μL של streptavidin 594. </li></ol> 2) בידוד של הרשתית מן העכבר Dissection הכלים הדרושים: 1 # 2 מלקחיים, 2 # 5 מלקחיים, מספריים ophthalmologic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העכבר על פי פרוטוקולים שאושרו, במקרה זה ה-CO 2 מחנק ועל גלגל העין enucleate בעדינות על ידי החדרת זווית # 2 מלקחיים מאחורי העין והסרת את גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלגל העין לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם פתרון תאיים. חותכים את עצב הראייה ואת כל שרירי extraocular המצורפת או רקמת החיבור באמצעות מספריים ophthalmologic. לחתוך את הקרנית עם מספריים ophthalmologic ולשלוף את העדשה באמצעות # 5 מלקחיים. לקרוע את בלובן העין בעזרת זוג מלקחיים # 5 ולהשתמש מלקחיים לנתק את עצב הראייה ברשתית שבו והלחמית נפגשים דיסק אופטי. לקלף בעדינות הרשתית הרחק עיינית. טיפ: האם כל צעד על הרשתית הן לפני המעבר לשלב הבא כדי למזער את הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להסיר הזגוגית מחוברת לרשתית. זה יכול להתבצע על ידי &quot;תופס&quot; את הזגוגית השקופה מעל הרשתית עם מלקחיים. זגוגי, אם הוסר בהצלחה, צריך להיות גלוי כחומר, ברור דביקות על מלקחיים. טיפ: בחותכו הרשתיות ב וחצי לאחר ההסרה של הזגוגית יהיה למקסם את כמות רקמת שמיש ולעשות הרכבה בחדר קלה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הרשתיות בפתרון תאיים מחומצן בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם אור הסביבה מינימלי עד שהם מוכנים להתעכל. הרשתית ניתן לאחסן בצורה זו עבור ~ 6 שעות. </li></ol> 3) טיפול של הרשתית בתערובת האנזים הרכבה בתא הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot של collagenase / hyaluronidase בתמיסה 500 תאיים μL, הפתרון מקום בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ ולהעביר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הרשתית, מכיליםing צלחת פטרי, מכוסה בחושך, ב O2 95% / 5% CO 2 בסביבה במשך 15 דקות עם תסיסה עדינה. צעד זה מסייע בעיכול כל זגוגי הנותרים ומאפשר גישה קלה יותר שכבת תא גנגליון. עצה: עבור הרשתיות של בעלי חיים צעירים עם זגוגי פחות או אם הם נצפו תופעות לוואי, זמן יכול להתקצר ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הרשתית ממדיום אנזים המכיל ולשטוף בהרחבה פתרון תאיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך ההקלטה קאמרית 6 עם שכבת photoreceptor כלפי מטה. וויק משם נוזלים הנותרים עם טפטפת או רקמות לרדד הצדדים של הרשתית לשטח רקמות נזהר לגעת רק בשולי הרשתית, במיוחד הימנעות ממגע עם שכבת תא גנגליון. מניחים טבעת פלטינה עם רשת ניילון על הרשתית לעגן את הרקמה מיד למלא את התא עם פתרון תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית הקלטה לבמה מיקרוסקופ, לצרף צינור עבור זלוף הכבידה יניקה ואקום לצרף חוט הקרקע. </li></ol> 4) לוקליזציה של תאים EGFP הגנגליון להביע וגירוי אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הרשתית על ידי כוח הכבידה עם פתרון תאיים על 1 שיעורי mL / min או מהיר יותר. עצה: אם קצב טפטוף איטי מדי, הרקמה לא יהיה מספיק חמצן איתות הסינפטי יכול להיות מופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה הקלטה עם פתרון תאיים והכנס אותו לתוך מחזיק פיפטה. טיפ: pipettes עם התנגדויות בטווח של 3 עד 5MΩ לתת את התוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הרשתית תחת אינפרא אדום התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי 10X, NA 0.3) כדי למקם את פיפטה ההקלטה. אור אינפרא אדום משמש לצמצם את החשיפה הרשתית לאור הנראה ולמזער הסתגלות קלה. מעבר הגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי, NA 0.8) ולהביא אלקטרודה לתוך נוף מעל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי), להאיר את הרשתית עם epifluorescence (480 ננומטר במשך EGFP) ובחר תא גנגליון סימן פלורסנט על צג המחשב באמצעות קלטת (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה DIC אינפרא אדום, מיקום האלקטרודה הקלטה ליד התא גנגליון ממוקד (איור 1A). אזור נקי מיד מכסה תא על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין אלקטרודה הקלטה באמצעות מזרק פלסטיק 12cc קשור לבעל פיפטה עם צינורות פוליאתילן. על המגבר, אפס כל קיזוז מתח. אלקטרודה מקום על תא גנגליון שנבחרו עד גומת חן מופיע על פני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המגבר במצב מהדק מתח, להחיל על הדופק לבדוק ולנטר את העברת הזרם דרך פיפטה. החל לחץ שלילי כדי ליצור חותם בין האלקטרודה בתא. שחרור לחץ שלילי כאשר התא מתחיל חותם ולהמתין מחזיק הנוכחי מעיד על חותם חשמל GΩ בין הממברנה של התא פיפטה. החל פולסים עדין של לחץ שלילי עד הארעיים קיבולי להופיע ולאחר מכן שחרר כל הפעלת לחץ. טיפ: אם (סדרה) הגישה התנגדות גבוהה (&gt; 30MΩ), זה יכול להיות לעיתים קרובות על ידי להשתפר נוסף, פולסים עדין מאוד של לחץ שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חותם יציבה הושג להחיל הדופק של לחץ שלילי. אחרי מצב התא כולו מתקבל, לאפשר לתא חשוך להסתגל במשך 5 דקות. שיא, במצב הנוכחי בתגובה, מהדק לגירוי, שדה מלא אור לבן (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ההקלטה, Alexafluor-594 יהיה מתפזרת על דנדריטים. נותב ניתן דמיינו תחת epifluorescence ב 594 ננומטר משמש כדי לקבוע אם תא הגנגליון הוא on-, Off-או Bi-מרובדת על ידי מעבר בין אופטיקה אינפרא אדום ו epifluorescence DIC 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם neurobiotin נכלל פיפטה ו הרשתית הולך להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה, אז פיפטה חייב להיות חזר בו בעדינות כדי לספק הפרעה מזערית של הממברנה. </li></ol> 5) ניתוח של האנטומיה של תאים הגנגליון מוקלט מילוי עם neurobiotin מאפשר ניתוח מפורט יותר המורפולוגי של תאים הגנגליון הבאים ההקלטה. עצה: אם מתאמים ספציפיים בין תא גנגליון רשמה ומורפולוגיה מפורט הרצוי, זה עשוי להיות הטוב ביותר כדי להקליט למלא רק אחד RGC לכל הכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם neurobiotin נכלל הפתרון תאיים אז במקום הרשתית בפתרון paraformaldehyde ולתקן לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב-PBS, לפחות 2 שעות, לפחות 6 שינויים. מעבירים את הרשתית לצלחת המכילה פתרון חסימה. השאר בחסימת פתרון 2 שעות, בטמפרטורת החדר על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון חוסם את הפתרון streptavidin. דגירה 2 ימים 4 ° C על שייקר. שוטפים את הרשתית של PBS, 6 שטיפות, 20 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתית עם Vectashield בשקופית זכוכית.הרשתית יש להציב עם לתאי הגנגליון למעלה. בצע מיקרוסקופיה confocal (תרשים 1C). </li></ol> נציג תוצאות אם הרשתית בריא לנתיחה בוצעה בהצלחה, בתאי הגנגליון הפרט צריך להיות גלוי תחת DIC בהגדלה גבוהה (איור 1 א). הרשתית לא בריאה יהיה גרעינים גדולים, מגורען ויש מבוטלים. אם התגובה הסינפטי של תא גנגליון נתון שלם, אז התא צריך להגיב בתחילת אור או לקזז עם פוטנציאל פעולה, במקרה של תא גנגליון מהותית, רגישים (איור 1B), שלילת קוטביות מתמשכת. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. לוקליזציה, הקלטה, מכתים התא שכותרתו fluorescently הגנגליון ברשתית. (א) RGC GFP חיובית דמיינו תחת תאורה epifluorescent בהגדלה 40X (פאנל משמאל) תחת תאורה DIC (פאנל מימין). (ב) אור בתגובה Synaptic תא רגיש לאור מיסודם M2 הגנגליון ברשתית רשמה במצב כל תא מהדק הנוכחית מ RGC שכותרתו fluorescently. (ג) M1 רגישים מהותית תא גנגליון ברשתית כי זוהה תחת epifluorescence, ממוקד עבור כל הקלטה תאים, מלא neurobiotin, ומעובד לאחר מכן על אימונוהיסטוכימיה.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

טכניקה זו החלה על כל תא גנגליון ברשתית הקלטות של הרשתית מבודד. אמנם בשורה העכבר בשימוש מעל רגישים באופן מהותי, melanopsin-לבטא RGCs מסומנים עם EGFP 2, 5, פרוטוקול זה ניתן להעברה בקלות אחר קווי RGC שכותרתו fluorescently או ניתן להכליל להקליט RGCs שנבחרו באופן אקראי גם כן. טכניקה זו חש?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

הצעדים הראשונים בחזון חוליות להתרחש כאשר אור מגרה את מוט חרוט קולטני האור ברשתית 1. מידע זה הפרדה מכן לתוך במה שמכונה המסלולים לסירוגין. Photoreceptors אות מידע אור על התאים דו קוטבית (BCS), אשר depolarize בתגובה מגדיל (ביום BCS) או יורד (כבוי BCS) בעוצמת האור. הפרדה זו של מידע אור נשמר ברמה של התאים הגנגליון ברשתית (RGCs), אשר יש דנדריטים stratifying ב sublamina או כיבוי של השכבה הפנימית plexiform (IPL), שם הם מעוררים לקבל קלט ישירות כבוי BCS, או stratifying ב sublamina ביום של IPL, שם הם מקבלים קלט מעוררים ישיר ב BCS. הפרדה זו של מידע בנוגע להגדיל או להקטין את התאורה (לסירוגין מסלולים) נשמרת וסימן המוח במקביל. RGCs הם תאים הפלט של הרשתית, ועל כן הם תא חשוב ללמוד כדי להבין כיצד מידע האור הוא אותת גרעינים ויזואלי במוח. ההתקדמות בגנטיקה העכבר מעל בעשורים האחרונים הביאו מגוון של פלורסנט העכבר קווי הכתב שבו אוכלוסיות מסוימות RGC מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי כדי לאפשר זיהוי של תת RGC 2 3 4 וספציפי מיקוד הקלטה אלקטרו. כאן, אנו מציגים שיטה הקלטה התגובות אור מתאי הגנגליון שכותרתו fluorescently בהכנה, פגע ברשתית מבודדים. זו הכנה רשתית מבודד מאפשר הקלטות RGCs בו סוכת הדנדריטים הוא שלם התשומות לרוחב סוכת הדנדריטים כולה RGC נשמרים. שיטה זו ישימה על פני מגוון רחב של תת תא גנגליון, והוא מקובל מגוון רחב של תא בודד טכניקות פיזיולוגיות.

Watch this Scientific Journal Video about An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  University of Minnesota. מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

Video: An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

בידוד רשתית עכבר וטיפול במתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

מחבר זרקור: הכנה מלאה מבוססת מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...