El estudio está respaldado por EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvención DK-081527, 072473-DK y DK-20595 de la Universidad de Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal principales modelos), y un regalo de la Fundación de la Familia Kovler.

1. La creación de cortes virtuales de inmunohistoquímica imágenes teñidas <ol><li> StereoInvestigator abierto. Coloque la lámina limpia la celebración de la muestra en el soporte de microscopio y visualizarla en el Investigador Stereo haciendo clic en &quot;adquisición&quot; y luego &quot;Imagen en vivo&quot; (Adquisición de imágenes en vivo →). Determinar los niveles de exposición para cada canal, en nuestro ejemplo concreto, el canal 2 se utiliza para DAPI, Canal 3 de la GFP, RFP para Channel 4, Channel 5 para Cy5, y el Canal 6 de Cy7. Utilice la opción &quot;Histograma de vídeo&quot; ventana, que muestra la intensidad de la fluorescencia, para determinar el nivel de exposición. Adecuada la intensidad de fluorescencia se alcanza cuando la intensidad de las colas en el extremo derecho del histograma de vídeo. Los niveles de exposición se puede cambiar en la &quot;configuración de la cámara&quot; de la ventana. El histograma de vídeo se puede enfocar con la rueda de enfoque del microscopio. </li><li> Antes de crear un segmento virtual, el contorno de la muestra al hacer clic en la pantalla en un punto alejado de la muestra, que va a marcar un punto de referencia, a continuación, haga clic en el contorno de la muestra. Cuando el contorno esté completa, haga clic derecho y seleccionar &quot;Cerrar contorno&quot; para conectar los puntos de comienzo y fin. </li><li> Una vez que el contorno está cerrado, la captura de un segmento virtual de la muestra (Adquisición → Adquirir Cortar Virtual). Cuando las opciones Cortar Virtual ventana abierta, seleccione &quot;High Speed ​​Adquirir&quot;, así como el enfoque automático, desmarcando la casilla junto a &quot;Manual&quot;. Guarde el archivo. </li><li> El corte virtuales pre-enfoque debe ser calibrado mediante la selección (clic derecho → Añadir a la lista de sitios de enfoque) y manual de enfoque varias secciones al azar, es decir, los sitios, en la vista previa rebanada virtual. Cuando varios sitios se han centrado, iniciar la rebanada Virtual (clic derecho → iniciar el segmento virtual con el enfoque previo). Después de la rebanada virtual de la muestra se completa la primera, cambiar al canal siguiente y ajustar la exposición en consecuencia. Repita los pasos 4 y 5 para cada canal. </li></ol> 2. Asistida por ordenador en dos dimensiones de análisis La cuantificación de los islotes <ol><li> Las imágenes se procesan mediante una macro ImageJ llamado &quot;IHCVS&quot;, que primero se prepara para el análisis de imágenes cargadas y cuantifica las características de los islotes, como la composición celular (es decir, cada área de la beta, alfa y delta-poblaciones de células, y los islotes zona en el valor de la suma). La pila se divide en sus canales diferentes y en ImageJ, donde cada canal se muestra una imagen por separado sobre la base de la tinción inmunohistoquímica. Cada imagen es automáticamente un umbral, después de que una imagen de 8 bits en blanco y negro, o una máscara, de la imagen de un umbral se produce. Las imágenes de canales separados se suman aritméticamente en una máscara compuesta, y construido en ImageJ es el análisis de partículas se lleva a cabo sobre la imagen compuesta. </li><li> ROI luego son identificados, excluyendo las partículas más pequeñas que una sola de las células beta (&lt;170 m 2, superficie que se calculará con un diámetro de unos 15 m; Hara et al, 2003).. El rendimiento de la inversión resultante se analizaron y cuantificaron utilizando ImageJ, la cuantificación puede incluir el perímetro (distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez en el número 1.0 describe un círculo perfecto), el diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) y el centro las coordenadas de cada región analizada de manera que la distribución de los islotes pueden ser analizadas matemáticamente utilizando distintas combinaciones de estos parámetros y trazados en un gráfico 3D, los datos de que se utilizará para el modelado matemático. Una sola imagen rebanada virtual es analizada en 30 segundos. Varias imágenes pueden ser analizadas mediante la incorporación de la secuencia de comandos de procesamiento de imágenes y análisis en un bucle con el apoyo de la sintaxis de lenguaje de macros ImageJ. El circuito se abre todos los archivos en un directorio dado, analiza las imágenes, y los resultados los resultados en una nueva ubicación como un archivo de Excel. </li><li> Los resultados agregados se guardan en una hoja de cálculo Excel, el almacenamiento de datos, tales como área, perímetro, circularidad, diámetro de Feret, y centro de los islotes de cada islote, junto con los números correspondientes marcados en la imagen. </li></ol> Análisis computacional y configuración de histograma <ol><li> Scripts Mathematica, que se ejecutan automáticamente una vez iniciado, se utilizan para procesar los datos recogidos de hoja de cálculo, que asciende a cientos de miles de entradas. Uno de los procesos críticos que se ejecutan es un análisis de frecuencia, que construye un histograma para examinar la distribución del tamaño y también para determinar los valores atípicos en los datos. En el guión, el área total de los islotes se mide y se compara con otros parámetros, en particular a los puntos de tiempo o la edad del páncreas, y en consecuencia se muestra en un gráfico. </li></ol> 3. Reconstrucción tridimensional de las dos imágenes dimensionales Cortar inmunohistoquímica manchadas Virtual La reconstrucción en 3D de cortes virtuales <ol><li> Copia de la escritura (&quot;im_jp2_2_tiff&quot;) en el directorio (es decir, la carpeta) quecontiene las imágenes JP2. Ejecutar el script con el shell de Linux, escriba &quot;./im_jp2_2_tiff&quot; en la consola y luego pulsar enter. Ejecutar este script se convertirá automáticamente todas las imágenes JP2 en el directorio en archivos TIFF, que es el formato utilizado en la construcción y la cuantificación de las tres dimensiones de las pilas de los cortes virtuales. (Nota:. Escriba &quot;chmod + x im_jp2_2_tiff&quot; si el guión no funciona, lo que convertirá el archivo de texto en un script para que pueda funcionar correctamente) </li><li> Cuando todas las imágenes capturadas se han convertido de JP2 en los archivos TIFF, que están listos para ser utilizados para el análisis de ImageJ. </li><li> Con ImageJ, abrir todas las imágenes de la primera muestra (cinco imágenes en este caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) y los combina en una sola imagen (Image Color → → Combinar canales). Repita este proceso para cada una de las muestras. Cuando todas las muestras se han combinado en una sola imagen, limpiar las imágenes mediante la selección de regiones no deseadas con el &quot;Selecciones Polígono&quot; herramienta de relleno y en (Editar → Fill). (Cambiar el tamaño de las imágenes a un tamaño menor, si es necesario). A continuación, convertir cada imagen en una imagen en color RGB (Imagen → → Tipo de color RGB). Por último, crear una pila de las imágenes (imagen → → Pilas de imágenes de las pilas), después de lo cual aún se pueden alinear con la &quot;Pila Reg&quot; plug-in, si es necesario. En última instancia, la fusión de los canales y luego combinar las imágenes en 3D crea un montaje de todos los islotes en el páncreas. Para ver la imagen, haga clic en &quot;Plugins&quot; y luego &quot;visor 3D.&quot; </li></ol> 4. Mapeo de los islotes Recolección de Pilas de imágenes <ol><li> Situar a los islotes pancreáticos montar todo bajo el microscopio. </li><li> Abra el software Slidebook. Acceder a la &quot;Captura y Control de enfoque&quot; presionando &quot;Ctrl + Shift + E.&quot; En el &quot;control de enfoque&quot; de la ventana, fijó el objetivo de 20X o 40X, dependiendo del tamaño de la isleta. Aplique el agua si se utiliza una inmersión en agua lente del objetivo. </li><li> Con el fin de utilizar el ocular del microscopio para localizar islotes, ajuste &quot;Bin&quot; de 2X y establecer el conjunto de filtros para Usuario1 en el &quot;Control de enfoque&quot; de la ventana. &quot;Selección de emisión&quot; se debe establecer en los ojos del 100% y de densidad neutra a 1. Haga clic en &quot;buenas prácticas agrarias ey&quot; y luego &quot;Abrir Fluor&quot;. </li><li> Para visualizar la muestra en Slidebook, volver a orientar los controles de la ventana y cambiar &quot;Filtrar&quot; para &quot;en vivo&quot; y haga clic en &quot;buenas prácticas agrarias ds.&quot; Utilice el joystick para el centro de la isleta en la Cámara una ventana de la mejor manera posible. El foco a una profundidad de algún lugar cerca del centro de la isleta, donde las células se pueden discernir con facilidad. </li><li> En el &quot;foco de la ventana de controles&quot;, seleccione la pestaña &quot;Z&quot;. Haga clic en situado en la esquina superior izquierda de la ventana para ajustar la profundidad actual como punto de referencia. Utilice el control alcance para desplazarse hasta la profundidad más alta del islote en el que las características se pueden distinguir con claridad y haga clic en &quot;Set Top&quot;. Desplácese hasta la parte inferior de la isleta y haga clic en &quot;Bottom Set.&quot; Haga clic en &quot;Go&quot; para volver al punto de referencia. </li><li> En la ventana de captura, ajuste &quot;Factor Bin&quot; a &quot;2X&quot; y establecer &quot;Filtrar&quot; para &quot;en vivo&quot;. Establecer el &quot;tipo de captura&quot; y &quot;3D&quot; (y sólo en 3D). En la parte derecha de la ventana, haga clic en &quot;Usar posiciones superior e inferior.&quot; Haga clic en &quot;Volver al punto de referencia después de la captura&quot;. Establecer el &quot;Step Size&quot; a &quot;3&quot;. </li><li> Debajo de la &quot;Caja de conjuntos de filtros&quot;, seleccione DAPI ESD, las buenas prácticas agrarias ESD ESD PP, y Cy5 ESD. Para cada uno, haga clic en &quot;encontrar el mejor&quot; en &quot;Ajuste de la exposición,&quot; y luego haga clic en &quot;Test&quot; para asegurarse de que la exposición seleccionada es la adecuada. Haga clic en &quot;Inicio&quot; para comenzar la captura. </li><li> Cuando la captura se completa, ajustar los niveles como sea necesario y cambiar el color de muestra para la RFP en blanco. Guardar la diapositiva e ir a Ver → Exportar → TIFF serie. Escriba el nombre de la diapositiva con un guión al final y guardarlo. Decenas de cada uno de los archivos TIFF se crean, por lo que puede ser útil para mantener la pila de cada islote de la imagen en una carpeta separada. </li></ol> Mapeo de Pilas de imágenes <ol><li> Abrir Investigador Stereo. Visualizar la imagen mediante la apertura de las pilas de la imagen (Archivo → → Pila Pila imagen Abrir imagen). En el &quot;menú de la imagen de escala,&quot; set &quot;distancia entre las imágenes&quot; de 3,00 micras. Para corregir el binning 2X en Slidebook, seleccione &quot;Reemplazar X y Escala Y&quot; y &quot;especificada por el usuario para la fuente de X y Y&quot; Escala, y entre 0,65 para X e Y. </li><li> Centro de la imagen haciendo clic en el centro de la isleta de interés en la &quot;ventana de Macro&quot;. Marque al menos una célula con el marcador adecuado. Las células beta aparecerá en verde, las células alfa que aparecen de color rojo, y las células delta aparecen de color blanco, el uso de marcadores 2 (un círculo hueco) para marcar las células beta, marcador de 5 (un triángulo hueco) para marcar las células alfa, y el marcador de 6 ( un triángulo hueco) a las células delta. Las células deben estar marcados en el centro de su núcleo, que aparecen de color azul si la muestra ha sido teñidas con DAPI. </li><li> Una vez que al menos una célula se ha caracterizado, mostrar la &quot;Vista ortogonal&quot; usando el icono en el menú superior. Marque &quot;Z-Filter&quot; y &quot;simétrica&quot;. El rango de should se establece en 15,00. Comenzando por el nivel 0.0 Z, desplazarse por el islote utilizando la rueda del ratón y marcar cada celda con el marcador adecuado. Cada célula se debe marcar una sola vez en el centro de su profundidad. Al terminar marcando cada uno de los Z-niveles, el &quot;Z-filter&quot; casilla de verificación se puede desactivar. Esto le mostrará todos los marcadores de todos los niveles de Z-. </li><li> Cuando cada célula se ha caracterizado, guarde el archivo como un &quot;DAT&quot; del archivo, y luego ir a Archivo → Exportar seguimiento. Guardar el trazado como un &quot;txt&quot;. Haga clic en &quot;nuevo archivo de datos&quot; para borrar el espacio de trabajo antes de intentar asignar nuevos islotes. </li></ol> 5. Los resultados representativos: La preparación de los cortes virtuales a partir de una muestra de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas permite examinar todas las células endocrinas (alfa, beta, delta y las células) en todo el páncreas, los dos juntos como islotes (Figura 1) e individualmente en canales separados ( Figura 1B). Con la ayuda de programas informáticos y los guiones, un análisis de la masa de datos a gran escala se pueden realizar en estos cortes virtuales. En concreto, un análisis de partículas de las máscaras compuestas (fig. 1C) se emite como una tabla de estadísticas que contienen parámetros tales como la zona de los islotes, el perímetro (la distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez, donde 1.0 representa un círculo perfecto), y diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) de cada islote detectado (Figura 1D). El análisis a gran escala de estos resultados, las imágenes en la producción del número total de los islotes y los histogramas de distribución de tamaño, así como una comparación detallada de las partículas alfa y beta y delta de células áreas. Además, cada sector virtual se toma a una profundidad de aproximadamente 5 micras, y todos los individuales rebanadas virtuales en 2D son más apilarse para crear una reconstrucción en 3D de la muestra de páncreas entero. Mapeo islote muestra otro ejemplo no sólo de la captura de islotes en 3D, sino también de información detallada con ayuda de computadora de análisis. Asignación de los islotes consiste en la captura de los islotes distintos (Figura 2A) y la posterior marcado de alfa, beta y delta-células en varios Z-planos (Figura 2B) para visualizar un islote en 3D (Figura 2 C, D). El análisis automatizado de matemáticas de los islotes mapa muestra su composición celular y la arquitectura, incluyendo las distancias de la célula-célula (Figura 2 E) y las distribuciones de probabilidades acumuladas de distancia célula-célula (Figura 2F). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Gran escala de captura y análisis de la distribución de los islotes con rebanada virtual. A. Virtual vista rebanada de una sección de páncreas humanos. a. La tinción inmunohistoquímica para la insulina (verde), el glucagón (rojo), la somatostatina (blanco) y DAPI (azul). b. Construcción de 8-bit máscara después de umbralización automática. Un área de caja se magnifica en las vistas de BB de cada canal. a. delta-células, b. las células beta, c. las células alfa, y d. fusionó imagen compuesta. C. Análisis de partículas realizado en la máscara de compuestos. Tenga en cuenta que cada estructura de los islotes como grupos de células pequeñas es numerada (resaltado en azul). Estadísticas D. tabla de diversos parámetros medidos para estructuras individuales, que tienen identificadores que corresponden a las etiquetas se muestra en la C. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 2. Análisis de Slice Virtual inmunohistoquímica. A. gráfico de dispersión 3D de la figura 1 muestra la distribución de tamaño y forma de cada uno de los islotes de parámetros como la superficie, la circularidad y el diámetro de Feret. B. gráfico de dispersión 3D de la figura 1 muestra la composición de los islotes celulares y el tamaño. C. La distribución de tamaño de los islotes del análisis de la sección humana de la figura 1 equipada con una distribución de densidad de probabilidad lognormal. D. Análisis Matemático de las relaciones composición celular (células beta en color verde, las células alfa y delta en rojo las células en azul) para cada intervalo de diámetro islote efectiva de la figura 1. E. a. Islote de distribución de tamaño de los análisis de muestras al azar de inmunohistoquímica (izquierda). Islote de distribución de tamaño de análisis rebanada virtual (derecha). b. Log-normal de comparación gráfica de análisis de un muestreo aleatorio de inmunohistoquímica (rojo) y el tramo virtual (azul). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Islet la cartografía y el análisis matemático de la composición celular y la arquitectura. A: captura de pantalla que muestra un plano focal simple de una pila 3D de las imágenes reconstruidas de un islote humano cargado en estéreo-investigador (las células beta en color verde, las células alfa en rojo, el delta-células en blanco, y los núcleos en azul) . B: las imágenes de fluorescencia (izquierda) y los correspondientes datos cartográficos (derecha) en tres planos focales diferentes se muestra en un intervalo de 10 micras. C: visión representativa de datos 3D reconstruido islote de mapeo. D: La reconstrucción en 3D de los cuartos de rodajas de islotes sobre la base de las coordenadas obtenidas mediante la asignación de los islotes. E: El análisis matemático de la composición celular y la arquitectura. LEFT. Frecuencia relativa de las distancias de célula a célula entre dos células en una población de células individuales. Derecha. Frecuencia relativa de las distancias de célula a célula entre dos poblaciones diferentes de células. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) de prueba. Izquierda. Probabilidades acumuladas de la célula a célula de distribución de la distancia para el alfa-a-alfa, beta-beta-a, y las células delta a delta. Derecha. KS distancias de los correspondientes tres probabilidades acumuladas.

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	<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l., Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture+-+a+comparative+study.">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li></ol>

El asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación que aquí se presenta pagar cuatro puntos clave en los estudios de los islotes pancreáticos: (1) Un análisis a gran escala de muestras de páncreas proporciona una visión completa de la distribución del tamaño total del islote y la arquitectura del islote. (2) La reconstrucción en 3D y el análisis matemático de la composición celular y la arquitectura de facilitar aún más el examen de la disposición espacial de las células endocrina...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus </td>
<td>IX-81
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture

Los islotes pancreáticos es un único micro-órgano integrado por varias células secretoras de hormonas endocrinas, tales como las células beta (insulina), las células alfa (glucagón), y delta-células (somatostatina) que están incrustados en los tejidos exocrino y comprenden 1 - 2% de todo el páncreas. Hay una estrecha correlación entre el cuerpo y el peso del páncreas. Total de masa de células beta también aumenta en forma proporcional para compensar la demanda de insulina en el cuerpo. Lo que escapa a esta expansión es proporcional la distribución del tamaño de los islotes. Los animales grandes, como los seres humanos comparten similares distribuciones de tamaño de los islotes en ratones, lo que sugiere que este órgano micro-tiene un tamaño determinado para ser funcional. La incapacidad de los páncreas de animales grandes para generar islotes proporcionalmente más grande se ve compensada por un aumento en el número de islotes y por un aumento en la proporción de grandes islotes en su distribución global de tamaño islote. Además, los islotes muestran una plasticidad sorprendente en la composición celular y la arquitectura entre las diferentes especies y también dentro de la misma especie en diferentes condiciones fisiopatológicas. En el presente estudio, se describen nuevos enfoques para el análisis de los datos de la imagen biológica con el fin de facilitar la automatización de los procesos de análisis, que permiten el análisis de las colecciones de datos amplio y heterogéneo en el estudio de tales procesos dinámicos biológicos y estructuras complejas. Estos estudios se han visto obstaculizados por las dificultades técnicas de muestreo imparcial y la generación de grandes conjuntos de datos para capturar con precisión la complejidad de los procesos biológicos de la biología de los islotes. Aquí se muestran los métodos para recoger imparcial &quot;representante&quot; de datos dentro de la limitada disponibilidad de muestras (o reducir al mínimo la recogida de muestras) y los parámetros experimentales estándar, y analizar con precisión la compleja estructura tridimensional de la isleta. Asistida por ordenador permite la automatización de la recogida y análisis de grandes conjuntos de datos y también asegura interpretación imparcial de los datos. Además, la cuantificación precisa de la distribución de tamaño de los islotes y las coordenadas espaciales (es decir, X, Y, Z-posiciones) no sólo lleva a una visualización precisa de la estructura de los islotes pancreáticos y la composición, pero también nos permite identificar los patrones durante el desarrollo y la adaptación a las condiciones de alterar a través de modelos matemáticos. Los métodos desarrollados en este estudio son aplicables a los estudios de muchos otros sistemas y organismos también.

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Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Nuevos métodos asistidos por ordenador a gran escala de adquisición y análisis de muestras de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas se describen: (1) Cortar la captura virtual de toda la sección, (2) análisis de la misa de datos a gran escala, (3) Reconstrucción de 2D cortes virtuales , (4) la cartografía en 3D de islotes, y (5) El análisis matemático.

Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vistas.  University of Chicago. Nuevos métodos asistidos por ordenador a gran escala de adquisición y análisis de muestras de páncreas mediante inmunohistoquímica manchadas se describen: (1) Cortar la captura virtual de toda la sección, (2) análisis de la misa de datos a gran escala, (3) Reconstrucción de 2D cortes virtuales , (4) la cartografía en 3D de islotes, y (5) El análisis matemático.

Video: Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Investigación

Biología

Murine Pancreatic Islet Isolation

Páncreas murino aislamiento Islet

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

En la cuantificación in situ de las células beta pancreáticas misa en ratones

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...