The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

NOTA: Los experimentos presentados en este trabajo han sido aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad de Düsseldorf. 1. Preparación exosome <ol><li> Recoger la sangre entera en 3 tubos de citrato mediante venopunción (total de 9 ml). Verter la sangre en un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifugar la muestra a 1500 xg durante 20 min a 4 ° C para iniciar la separación de las células del plasma. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifugar la muestra a 2800 xg durante 20 min a 4 ° C para eliminar todas las células del plasma (plasma libre de células; PPC). Transferir el PPC para tubos de ultracentrifugación, 1 ml al tubo. </li><li> Centrifugar a 100.000 xg durante 90 min a 4 ° C para agotar exosomas. Eliminar 900 l de sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento en los 100 l restantes en el tubo de ultracentrifugación. Añadir 900 l de PBS. </li><li> Centrifugar de nuevo a 100.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Quite 900 l de supernatant. Vuelva a suspender el sedimento con los 100 l restantes. </li><li> Transferencia de 5 a 20 l de resuspensión en 40 ml de agua destilada. Se filtra la suspensión a través de un filtro de 450 nm para separar exosomas de partículas más grandes. Utilice esta suspensión final para la medida de la partícula. </li></ol> 2. Procedimiento de inicio del Instrumento de Rastreo de Partículas <ol><li> Inicie el programa haciendo doble clic en el icono del software. Haga clic en las distintas fichas de software (&quot;Check Cell&quot;, &quot;Medición&quot;, &quot;Análisis&quot;) para cambiar entre ellos durante todo el protocolo. </li><li> Siga las instrucciones de la pantalla para una aplicación automática del procedimiento de arranque. Seleccione las casillas de verificación de calidad, tanto para celular y alineamiento automático. NOTA: Cualquiera de estos pasos se puede repetir por separado si es necesario mediante el botón (A) o (B) pulsando en la pestaña de &quot;cheque en la celda&quot;. </li><li> Abra la entrada y la abertura de salida del instrumento NTA e inyectar 10 ml de agua destilada por la jeringa en el canal de la célula a través del puerto de entrada. Cierre el orificio de salida a medida que se inyecta la última cantidad de agua. Coloque un vaso debajo del orificio de salida para recoger solución residual. Asegúrese de que la célula de medición está libre de burbujas de aire y no jeringa burbujas de aire en el sistema. Cierre la puerta de entrada de inmediato. </li><li> Lleve a cabo el control de calidad celda haciendo clic en &quot;Aceptar&quot;. El software mostrará los resultados de calidad de células después de unos segundos. </li><li> Si las partículas todavía se visualizan en la pantalla de una imagen en directo del software o si el resultado de la comprobación de calidad sólo es buena o mala, repita el paso 2.3 hasta que las partículas restantes se retiran de la célula de medición. También repite el paso 2.3 después de cada medición para evitar la acumulación de partículas. Si la repetición de la inyección de agua destilada y verificación celular no produce un &quot;buen&quot; resultado, proceda a 2,9. </li><li> Preparar una suspensión de control que contiene uniforme 200 pol tamaño nmystyrene partículas que se utilizan para alinear los focos del láser y microscopio. Añadir una gota de la suspensión concentrada, proporcionado por el fabricante del instrumento, a 500 ml de agua destilada para obtener la concentración requerida de manera que 600 ± 100 partículas se muestran por pantalla en la vista en vivo. </li><li> Inyectar la suspensión de alineación en el instrumento NTA como se describe en el paso 2.3. Pulse el botón &quot;OK&quot; para iniciar la alineación automática, una rutina automatizada a través del cual el sistema buscará automáticamente la posición óptima de los dos focos. </li><li> Ahora, cuando aparece un mensaje que indica el sistema está listo para los experimentos, haga clic en Aceptar para iniciar la medición. </li><li> Ocasionalmente, limpiar el canal de la célula manualmente entre los experimentos mediante el lavado de la célula con una solución al 30% de etanol. Limpie el canal cada vez que el software muestra un informe de errores automático. </li></ol> 3. Medición de la Muestra <ol><li> Enjuague el canal con agua destilada antes de la EAmedición de la muestra ch (como se describe en el paso 2.3). </li><li> Inyectar la suspensión exosome (preparado en el apartado 1) en el canal, tal como se describe en el paso 2.3. </li><li> Ajuste los siguientes parámetros principales en el software según sea necesario: <ol><li> Sensibilidad. Con el fin de encontrar el rango de sensibilidad óptima, haga clic en el botón &quot;número de partículas vs. sensibilidad&quot; para mostrar una curva de partículas medidas por pantalla para diferentes niveles de sensibilidad. Elija un nivel de sensibilidad antes de la pendiente máxima de la curva. Un nivel mayor sensibilidad permite la visualización de las partículas más pequeñas, pero también aumenta las cuestiones relacionadas con el ruido de fondo. </li><li> Brillo mínimo. Elija un brillo inicial de 20 para la medición exosome utilizar esta función como un filtro. Regule este parámetro hasta en blanco fuera fuertemente partículas de dispersión de luz. Regular hacia abajo para amplificar débilmente dispersión de artefactos. Variar el brillo según sea necesario durante todo el experimento. NOTA: Las partículas que luz-Scatter superponerse demasiado fuerte y puede ser excluido del análisis por error. </li><li> Min y Max Size. Establecer un filtro digital para eliminar el ruido de píxeles y la dispersión no deseada de partículas de gran tamaño mediante la regulación del tamaño mínimo y máximo. Utilice un rango de 10 a 500 píxeles para la medición de los exosomas. </li><li> Shutter. Ajuste el período de tiempo que la cámara está abierto a 1/300 seg. </li></ol></li><li> Vive parámetros leídos: <ol><li> Cambiar entre una cámara digital y una vista operandi análogo en cualquier momento haciendo clic en el botón &quot;Live-imagen&quot;. </li><li> Durante todo el experimento, supervisar la barra de intensidad de dispersión, que muestra el estado de saturación de la muestra como un indicador de color codificado. No analizar exosomas si la barra de dispersión es de color rojo. En tal caso diluir aún más la muestra para evitar este fenómeno. Si la condición experimental prohíbe que una manipulación de la suspensión de la muestra, regular a la baja la sensibilidad o hasta de regular el brillo en el software-sjustes para mejorar los resultados de la medición. NOTA: Cuando se analizan muestras con una muy alta concentración de partículas de la dispersión se fundirá partículas individuales y ellos se cuentan como una sola partícula. </li><li> Tenga en cuenta el número de partículas contadas en el campo de visión de la pantalla. </li></ol></li><li> Haga clic en la pestaña &quot;valoración&quot;. </li><li> Seleccione los ajustes en el &quot;opciones de ejecución&quot; matriz. <ol><li> Antes de cada adquisición, seleccione &quot;movimiento de verificación &#39;para una prueba de la deriva de partículas de verificación repetida. Realice la prueba al menos una vez antes de iniciar todo el análisis. Si la desviación es superior a 20 m / seg, esperar antes de continuar la medición de manera que la muestra deja de fluir. </li><li> Seleccionar el número de experimentos (5) y el retardo de tiempo entre ellos (0). </li><li> Realizar un &quot;control de la muestra &#39;si es necesario. Esta prueba es parte de la alineación automática en el procedimiento de puesta en marcha y se puede repetir después como sea necesario. </li&gt; </ol></li><li> Por último, haga clic en el botón &quot;adquisición de vídeo ejecutar&quot;. En la nueva ventana, definir el número de ciclos (15) y el número de posiciones de medición (11). Nota: El cabezal láser y el microscopio se puede mover a analizar el número de partículas en 11 posiciones diferentes. Dependiendo de la demanda experimental, debe decidir si el experimento se debe realizar en una sola posición o en diferentes posiciones. <ol><li> Confirme la duración mínima vez que una partícula tiene que ser rastreado a ser contado como uno partícula individual mediante el establecimiento de la resolución de vídeo (bajo). A los resultados de menor resolución en una duración de seguimiento más corto. </li><li> Seleccione un nombre de archivo y haga clic en &quot;Aceptar&quot; para iniciar la medición. </li></ol></li></ol> 4. Interpretación de los resultados <ol><li> Ver los siguientes resultados y los parámetros que se muestran después de la medición en la pestaña &quot;resultados&quot;: (1) el número total de partículas trazadas, (2) Número medio de una parteicles por posición, y (3) la concentración de partículas. <ol><li> Ver la tabla promedio de resultado para la relación numérica del tamaño de partícula (diámetro, superficie y volumen) para el porcentaje de números de partículas, así como los valores de la media y la diferenciación estándar. </li><li> Utilice la tabla de análisis de picos si existe más de un pico en el análisis gráfico. Esta tabla muestra la distribución de partículas que son más pequeñas que el primer o segundo pico respectivamente. </li></ol></li><li> Ver el gráfico calculado después de la medición para ver una distribución de partículas por tamaño. Utilice los iconos en el modo de pantalla y por encima de la gráfica para cambiar la configuración. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

Se demuestra un protocolo detallado para el aislamiento exosome de la sangre y el presente seguimiento de nanopartículas como una novela y método innovador para medir el tamaño exosome y la concentración en un fluido biológico. En los experimentos presentados se utilizó sangre periférica humana como el origen de los exosomas. Sin embargo, otros orígenes, tales como orina, esputo, sobrenadante de cultivo celular, etc., también pueden ser utilizados como material de prueba. En base a la variabilidad biológica de la concentración de exosome en los seres humanos, ensayos de distintos individuos pueden ofrecer una concentración notablemente variable de exosomas. Sin embargo, la concentración de partículas en la sonda de prueba biológica puede tener un impacto en los resultados. Por lo tanto, se necesita un enfoque fiable y estandarizado para la dilución de las sondas. En el método presentado exosome que contiene el plasma se genera a partir de 9 ml de sangre entera periférica. El uso de centrifugación diferencial pasos un pellet exosome fue aislado de1 ml de plasma y se resuspendieron en 5 ml de agua destilada para dar lugar a la muestra de trabajo de los exosomas en suspensión. Este ajuste predefinido nos ha provisto de una concentración adecuada de partículas, es decir, la intensidad de dispersión apropiada durante NTA. Al lado el aspecto volumen y la dilución, la composición de las soluciones que se utilizan es también de importancia. Hemos utilizado el agua destilada para la final de resuspensión de exosomas. Por supuesto, también se pueden usar diferentes medios para la etapa de dilución final, de acuerdo con los requisitos de la instalación experimental. Sin embargo, en el caso de las mediciones de potencial zeta de soluciones iónicas, particularmente cuando el análisis de muestras con una capacidad de amortiguación, una dilución prudente en condiciones libres de turbulencia es útil. Para la comparación directa de múltiples muestras se recomienda mantener el mismo nivel de dilución para todas las muestras. Todos los ajustes excepto la sensibilidad y la resolución de vídeo se puede cambiar posteriormente utilizando el software de análisis ZetaView. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; A pesar de que los autores creen que el sistema establecido en el presente documento en la actualidad representa el instrumento más adecuado, no es el único sistema NTA disponible. Una serie de informes anteriores han empleado otros sistemas que se aplican los mismos principios NTA pero proporcionan otro diseño de instrumentos que va junto con algunas características diferentes 10. Creemos que los aspectos prácticos relativos a la manipulación de la muestra y la reproducibilidad de los resultados son de importancia central en la elección de la secuencia metodológica para la evaluación exosome. También creemos que un sistema de detección ideal debería eliminar los factores-dependiendo de usuario que pueden interferir con los resultados de las mediciones. El enfoque de análisis exosome que se presenta aquí cumple el criterio de fácil manejo en un alto grado. Como ventaja adicional, el análisis semi-automatizado de las muestras se realiza en un proceso rápido, generando resultados en un corto tiempo. Una visualización en línea de exosomas ayuda al analizador para gaen una idea inmediata de las características exosome, por ejemplo, la concentración bruta. Una adición muy simple pero elegante para la técnica de medición que se presenta aquí es el uso de anticuerpo marcado exosomas y la captura del rayo láser dispersada por el uso de un filtro anterior en frente del detector. De esta manera subpoblaciones exosome pueden distinguirse en función de sus antígenos de superficie y otras características de importancia biológica que son técnicamente accesibles a una tinción fluorescente selectiva. Una desventaja de la versión actual de nuestro instrumento de rastreo de partículas es el hecho de que en niveles muy altos de sensibilidad artefactos, tales como ruido de fondo pueden convertirse en la actualidad, que se basa en la pared del canal de la célula. Una solución técnica y la mejora del sistema actual podrían estar disponibles en un futuro próximo. Por este método reflejos de la luz de dispersión láser en la pared del canal se reducirá, lo que aumenta<html> la precisión de las señales medidas y los datos obtenidos y la reducción del límite de detección. Aunque el protocolo utilizado actualmente para el aislamiento exosome está bien establecida y el instrumento de rastreo de partículas aplicado tiene una resolución muy precisa con una distribución de tamaño menor de 30 nm, no hay garantía de que las partículas detectadas son de hecho totalmente cierto exosomas. Otras partículas, tales como fragmentos de células muertas o complejos de proteínas más grandes también pueden estar presentes en la suspensión exosome y dar lugar a falsas señales positivas. Un método fiable en la cual tal &quot;contaminación&quot; se puede excluir puede ser microscopía electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión o EM escaneo. Desafortunadamente, no hay marcador general y específica para los exosomas se ha identificado hasta ahora, aunque una serie de marcadores de superficie previamente propuestos han ganado una cantidad cada vez mayor de la atención, incluyendo tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11. &quot;&gt; Independientemente del futuro progreso de la investigación en biología exosome, especialmente en relación con marcadores específicos exosome, el protocolo que se presenta aquí proporcionará un poderoso método para el aislamiento y detección de exosomas. La concentración y el tamaño pueden ser determinadas fácilmente en un software asistida moda sencillo. La adición de marcadores fluorescentes selectivos o anticuerpos fluoróforo unido probablemente mejorarán aún más las posibles aplicaciones del enfoque presentado de NTA.

La función exacta de exosomas que circulan permaneció desconocido durante un largo período de tiempo. Incluso ahora el mecanismo de ruta completa de exosomas no se entiende completamente. Desde exosomas llevan principalmente se ha dado prioridad antígenos, proteínas y ARN (ARNm y miRNA) que los relaciona con su celular de sus padres de origen, su función como transmisores de señalización célula-célula. Muchos métodos diferentes se han descrito en la literatura para el aislamiento y la detección cuantitativa de exosomas 1,2. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre un &quot;patrón oro&quot;. Mientras tanto, la mayoría de los científicos que trabajan en el campo de la investigación exosome de acuerdo en que un método consistente de aislamiento es muy justificada para lograr un mayor grado de comparabilidad entre los distintos informes y estudios. Fluorescencia clasificación de células activadas (FACS) es la herramienta más común y frecuente para el análisis exosome 3. FACS tiene el benbenefi- que, a través de etiquetado de fluorescencia, las células de diferentes orígenes se pueden comparar en un solo paso. Las principales desventajas de FACS son que este método no es lo suficientemente sensible para identificar las partículas menores de 0,5 micras 4, mientras que los exosomas son generalmente entre 30-120 nm de diámetro 5, menos aún para medir su tamaño. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) son otras herramientas para el análisis de tamaño de partícula y la morfología de los exosomas. Sin embargo, tanto SEM y TEM tienen la desventaja de que la preparación de muestras consume mucho tiempo, ambos métodos implican pasos de trabajo intensivo y cada uno tiene un cierto riesgo de generación de artefactos. Ningún método es adecuado para la gran cantidad de muestras y caracterización de varios miles de partículas individuales de una muestra. Por otra parte, un análisis cuantitativo para la rutina diaria clínica donde las muestras tienen a menudo para ser analizada de manera simultánea o al menos en un período muy corto sedifícil de realizar. Técnicas de nueva generación ahora nos permiten analizar exosomas sin un intenso trabajo preparatorio previo (SEM por ejemplo, ambientales). Estas técnicas modernas son aún bastante incómodo para el análisis de grandes volúmenes de suspensiones que contienen los exosomas para determinar su promedio y distribución de tamaño 6. Otro método muy sensible para la visualización y análisis de los exosomas es el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA). Este método se aprovecha de dos principios diferentes de la física. En primer lugar, las partículas son detectados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. El segundo fenómeno se conoce como movimiento browniano, según la cual la difusión de diferentes partículas en una suspensión líquida es inversamente proporcional a su tamaño. En el último caso, el movimiento también depende de la temperatura y la viscosidad del líquido. Sin embargo, esta tasa está directamente relacionado con el tamaño de partícula y es utilizado por NTA. Utilizando suaveanálisis basado en cerámica, se graban las imágenes digitales de la luz dispersada de partículas individuales. Parcelas de puntos de luz repartidos y su velocidad de movimiento proporcionan los datos que facilite la determinación del recuento de partículas totales y distribución de tamaños. Esta técnica es particularmente potente para el análisis de partículas con un diámetro medio de menos de 100 nm. Las mediciones de tamaño y la concentración se realizan con el ZetaView browniano y análisis de electroforesis de vídeo con movimiento microscopio. Este es un servicio de la parte superior de nanopartículas análisis instrumento semi-automatizado para muestras líquidas (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas). Consiste en el analizador de rastreo de partículas, así como un ordenador portátil con el software utilizado para el análisis de datos. Muestras biológicas heterogéneos son los adecuados para este método en forma de suspensiones más homogénea de partículas inorgánicas. Un microscopio de dispersión de láser con una cámara de vídeo se utiliza para la detección de partículas y para la OBSErvación de su movimiento. Mientras que el eje microscopio es horizontal y centrado en el canal de celda llena con una suspensión que contiene los exosomas, el haz de láser está orientado verticalmente. Las partículas irradiadas por la dispersión de la luz láser, que se contabilizan en 90 ° por una cámara de vídeo digital a través del microscopio (Figura 1). La intensidad de la luz dispersada permite la observación de partículas mayores de 60 nm de diámetro. En tal escenario el brillo de una partícula no es la única indicación de tamaño de partícula. Cuando no se aplica campo eléctrico, el movimiento de partículas sólo sigue el movimiento browniano y puede servir como un indicador para el cálculo de tamaño de partícula. Sin embargo, el instrumento también es capaz de aplicar un campo eléctrico a través del canal de la célula. Cuando se somete a este campo, el potencial, la polaridad y el nivel de iónicos cargo de los exosomas suspendidos vuelven más determinantes de la dirección de su movimiento. La velocidad y la dirección resultado en un mo electroforéticahistograma bilidad. Mientras que encontrar un método óptimo para analizar exosomas aisladas es un problema, otro radica en el aislamiento eficaz de los exosomas de diferentes medios de comunicación, tales como la sangre, ascitis, orina, leche, líquido amniótico o medios de comunicación celular. Diferentes métodos han sido descritos hasta ahora, que se basa en la ultracentrifugación 1, reactivos de separación industriales (tales como Exoquick) 7, perlas magnéticas para el antígeno empleando separación 8 o ultrafiltración 9 pasos. En este protocolo se demuestra todo el proceso de aislamiento exosome mediante ultracentrifugación y mostramos cómo analizar la exosome resultante que contiene la suspensión a través del instrumento de seguimiento de partículas. Se proporcionan consideraciones específicas para el análisis de un medio de plasma o cultivo de células humanas exosomas derivados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

La muestra utilizada para esta demostración muestra una configuración óptima para la medición con una sensibilidad del 85%, antes de la pendiente máxima de la curva de sensibilidad (Figura 2). El brillo, el min / se eligieron los valores máximos como se recomienda en el protocolo. Una concentración de 5,3 partículas / ml x 10 6 se midió, mientras que el tamaño medio de las partículas era de 0,149 m, ​​la mayoría de ellos eran 0.137 micras. Los valores recibidos después de la medición se pueden guardar en un informe con un formato de archivo .pdf o como un archivo .txt para exportar a una base de datos. En el gráfico se puede ajustar según su preferencia, como se describe en el protocolo (sección 4). La secuencia de vídeo también se guarda y se puede utilizar para más tarde fuera de línea re-análisis. Sin embargo, en este análisis fuera de línea, los ajustes anteriores a la adquisición de la cámara no se pueden cambiar de forma retrospectiva. Con el fin de encontrar los ajustes óptimos de los parámetros de una medición, que aquí describimos ªe optimización de los parámetros del instrumento en el ejemplo de un tamaño estándar de poliestireno de 100 nm. La influencia de los dos parámetros, la sensibilidad y min / tamaño máximo en la imagen de vídeo y la distribución de tamaño de partícula se discute en detalle. Todos los demás parámetros se resumen en la Tabla 1. Una impresión visual del impacto de la sensibilidad (que varía de 50 a 94) en las imágenes analógicas y digitales se visualiza en la Figura 3. La información cuantitativa derivada de las imágenes se presenta en la Figura 4, basándose en los ajustes de la Tabla 1, Min = Tamaño 5 Tamaño y Max = 200. Una relación típica del número de partículas detectadas vs. sensibilidad se muestra en la Figura 4A. Entre 50 y 90, el número de partículas detectadas aumentó con la sensibilidad y aumentó dramáticamente por las sensibilidades&gt; 90. Se encontró un intervalo óptimo de sensibilidad entre 66 y 86 (A). Distribuciones de tamaño de partículas obtenidas con el DIFAjustes de sensibilidad ferente se muestran en la Figura 4B. Las distribuciones de tamaño de partícula representan la media de tres mediciones individuales. Durante demasiado baja sensibilidad (sensibilidad = 62, curva roja) sólo se analizaron unas pocas partículas resultantes en las estadísticas bastante pobres. El número de partículas analizadas aumentó con la sensibilidad y alcanza un óptimo entre 70 (curva amarilla) y 86 (curva de bronceado). Aumentando aún más el liderazgo de sensibilidad a un deterioro de la distribución del tamaño de partícula con el número de partículas que caen y distribución del tamaño de desplazamiento hacia tamaños más pequeños (sensibilidad = 94, curva azul). Figura 4C muestra la tendencia del diámetro x50 basado en el número (50% de partículas son más pequeñas que este diámetro) como una función de la sensibilidad. En el intervalo beige, la RSD de tamaño de partícula fue de menos de 8% y corresponde al intervalo óptimo en A. Las regiones rojas indican RSD&gt; 8% como resultado de las estadísticas pobres (sensibilidad demasiado baja) o amplia distribuciones con cambio a tamaños más pequeños (sensibilidad demasiado alta). Los ajustes de tamaño mínimo y máximo tamaño son los filtros aplicados a las imágenes digitales con el fin de eliminar las partículas con tamaños de punto más pequeños que Min Tamaño y mayores de Max Size. Debido a la capacidad para dispersar la luz, una partícula crea un punto de un cierto tamaño en una imagen digital. El tamaño de la mancha se mide como un número de píxeles (px). Cuando una partícula dispersa la luz muy bien (por ejemplo, partículas&gt; 200 nm o agregados), el tamaño del punto es bastante grande, por ejemplo,&gt; 500 px. El tamaño del punto es bastante pequeña (por ejemplo, &lt;10 px) para partículas pequeñas (por ejemplo, &lt;20 nm) en función del material de partículas. Tamaño de punto (px) no puede intercambiarse con tamaño de partícula (nm), ya que no son idénticos y no hay relación directa entre estas dos variables. Una optimización de Min y Max Tamaño permite al usuario filtrar los objetos no deseados tales como aglomerados (Max Size) o pequeñaobjetos tales como el ruido de fondo (Min Tamaño). La influencia de Tamaño Min / Max en la distribución del tamaño de partículas de un tamaño estándar de 100 nm se muestra en la Figura 4D (sensibilidad = 82). Cuando el intervalo se establece en pequeños tamaños de punto (por ejemplo, min = 1, max = 52; curva naranja), el número de partículas analizadas se reduce y el diámetro x50 basada número se desplaza ligeramente hacia tamaños más pequeños. Un ajuste para los puntos más grandes (min = 40, max = 1,000; curva roja) resulta en una amplia distribución de tamaño de partícula desplazado hacia tamaños más grandes. A fin de obtener la igualdad de número total de partículas, los límites de intervalo de distribuciones tanto naranja y rojo se ajustaron para que coincida con 80 partículas. La distribución de los ajustes óptimos (min = 5, max = 200; curva tan) consta de 360 ​​partículas. Una serie de experimentos exitosos se realizaron con exosomas aisladas por ultracentrifugación y medidos por NTA utilizando el sistema presentado. Los datos resultantes fueron altamenteconsistente y confirmado un alto nivel de reproducibilidad. Otros métodos de aislamiento deben mostrar resultados similares. Sin embargo, el paso de dilución fue identificado como un paso particularmente crítico y su impacto en las cifras totales calculadas de partículas tiene que ser re-evaluado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la configuración de la NAT. El / eje de vídeo microscopio y el rayo láser están orientados ortogonalmente entre sí, se cruzan en la sección transversal del canal de la célula. La luz dispersada por las partículas se muestra en la ventana &quot;Live View&quot; del software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Número de partículas frente a la curva de sensibilidad. El número de partículas frente a la curva de sensibilidad muestra las partículas en una posición en un momento durante una exploración automática de la sensibilidad. Esta visualización gráfica se usa para determinar las mejores preferencias para las mediciones iniciales. Un valor de sensibilidad se elige antes de la pendiente máxima de la gráfica. Es importante recordar que los artefactos no se eliminen en este experimento de prueba y pueden afectar a la gráfica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figura 3. Impacto de la sensibilidad en analógico y digital de imágenes. La visualización de las partículas en la pantalla de visualización en vivo se muestra para sensibilidades entre 50 y 94 por tanto analógicas (fila superior) und digitales (fila inferior) vistas. Cuando la sensibilidad es demasiado baja, se detectan sólo unas pocas partículas (a la izquierda). En una sensibilidad óptima las partículas aparecen como puntos individuales bien aisladas una de la otra (en el centro). En un comparativamente altos partículas sensibilidad fusionan dando lugar a mala calidad de imagen (a la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figura 4. Influencia de sensibilidad min y ajustes de tamaño máximo para una muestra de control de partículas de poliestireno de 100 nm (A) Parcela de sensibilidad frente al número de partículas detectadas.; el intervalo óptimo es 66-86, antes de la pendiente máxima de la curva. Distribuciones (B) Tamaño de las partículas obtenidas con varios ajustes de sensibilidad (62-94); gráficos para demasiado baja (62) o demasiado alto (94) de sensibilidad no captan la distribución del tamaño de partículas para la muestra de control de poliestireno 100 nm. (C) Número basada diámetro x50 frente a la sensibilidad; el error de x50 en el intervalo de color beige es inferior al 8%, el intervalo óptimo es de 66 a 86. (D) Impacto de Min y Max Tamaño de la distribución de tamaño de partícula; parámetros óptimos (min = 5 y max = 200) capturan la correcta distribución de la muestra de control. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Parámetros anteriores a la adquisición </td></tr><tr><td> Sensibilidad </td><td> variable </td></tr><tr><td> Obturador </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Velocidad de cuadros </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Resolución </td><td> Holagh </td></tr><tr><td> Ciclos </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Múltiples Adquisiciones </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Posición </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Parámetros posteriores a la adquisición </td></tr><tr><td> Min Brillo </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Tamaño máximo </td><td> variable </td></tr><tr><td> Min Tamaño </td><td> variable </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resumen de los parámetros anteriores y posteriores a la adquisición de ajuste del instrumento de seguimiento de partículas.

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement at JoVE.com

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.7K vistas.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Video: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Investigación

Biología

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

La ultrafiltración de flujo tangencial: &quot;en verde&quot; Método para la selección del tamaño y concentración de las nanopartículas de plata coloidal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Un Plugin para ImageJ Semi-automático Medición Hoja Forma

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Un método innovador para exosome cuantificación y medición de tamaño

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video