Los autores desean agradecer Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) y Nathaniel Snyder (Universidad de Pennsylvania) valiosa para los debates sobre la calibración de masas y el procesamiento de datos. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud con el número Premio R00CA168997. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de LC-MS Reactivos, Establecimiento de un método de cromatografía, y establecimiento de procedimientos de operación del instrumento <ol><li> Preparación de disolventes LC <ol><li> Preparar 500 ml fases móviles. A es acetato de amonio 20 mM y 15 mM de hidróxido de amonio en 3% de acetonitrilo / agua, pH final 9,0; y B es 100% de acetonitrilo. </li><li> Sin apretar tapar la botella, colocarlo en un baño de ultrasonido agua, y someter a ultrasonidos durante 10 minutos sin calentamiento adicional. (Este paso es asegurarse de que todas las sales de amonio se disuelven por completo y que no hay burbujas de aire residuales.) </li><li> Transferir 250 ml de disolvente a una botella de vidrio de 250 ml para el uso LC-MS, y mantener el resto a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar la solución de calibración rango de masa baja. Es importante utilizar una mezcla de calibración de gama baja masa a medida para aplicaciones de metabolómica para asegurar que las masas exactas se detectan en pesos moleculares bajos. <ol><li> Pesar 5 mg de ambos sodium fluoroacetato y ácido homovanílico y disolverlos en 5 ml de agua para hacer una concentración final de 1 mg / ml. Disolver diazinón en metanol para hacer una concentración final de 10 mg / ml. </li><li> Para preparar 1 ml de la solución de calibración de masa negativa baja, mezclar 960 ml de solución de calibración térmica negativa con 20 ml de fluoroaceate de sodio y solución de ácido homovanílico. Para hacer 1 ml de solución positiva calibración baja masa, mezclar 990 ml de solución de calibración térmica positiva y 10 ml de solución de diazinon. (La solución de calibración de baja masa debe almacenarse a 4 ° C y ser preparado fresco cada 2 meses.) </li></ol></li><li> Calibración de QE-MS en un rango bajo de masa <ol><li> Antes de realizar la calibración de bajo rango de masas, llevar a cabo una calibración de masas (m / z, 150-2,000) en los modos tanto positivos como negativos sobre la base de las instrucciones del fabricante. </li><li> Una vez que pasa una calibración de masa regular, ajustar el rango de exploración de 60 a 900 m / z en el panel de control de instrumentosy se aplica un CID fuente de 25 eV para el modo positivo y 35 eV para modo negativo. (Esto le dará señales robustas del ión fragmento de la cafeína y el ión sulfato. El rango de exploración aquí es fijo, porque la última m / z no debe ser mayor de 15x de la m el inicio / z) </li><li> Una vez que la fuente de iones es estable, a continuación, realizar la calibración personalizada. Nota: Una fuente estable se define como menos de 10% de la variación de la corriente total de iones en el modo positivo, y menos de 15% en modo negativo. Los iones de calibración correspondiente personalizados y m / z se enumeran en la Tabla 1. </li></ol></li><li> Establecer la instrumentación LC-MS para el análisis de metabolitos polares. LC está acoplado a un QE-MS para la separación y detección de metabolito. <ol><li> Equipar el QE-MS con una sonda de ionización electrospray calentado (H-ESI). Establezca los parámetros de ajuste pertinentes para la sonda que se enumeran: la temperatura del calentador, 120 ° C; gas envolvente, 30; gas auxiliar, 10; barrer de gas, 3; voltaje, 3,6 kV para rociarmodo positivo y 2,5 kV para modo negativo. Ajuste la temperatura del capilar a 320 º C, y S-lente a 55. </li><li> Construir un método de exploración completa de la siguiente manera: Completo Rango de escaneado: de 60 a 900 (m / z); Resolución: 70000; tiempo máximo de inyección: 200 mseg con tiempos típicos de inyección de alrededor de 50 ms; control automático de ganancia (AGC): 3.000.000 iones. Estos ajustes dan lugar a un ciclo de trabajo de alrededor de 550 ms para llevar a cabo exploraciones en modo positivo y negativo. </li><li> Establecer el método de cromatografía. Emplear una columna de amida (100 x 2,1 mm di, 3,5 mm) para la separación de compuestos a temperatura ambiente 13,15. La fase móvil A es como se describe anteriormente, y la fase móvil B es acetonitrilo. Utilice un gradiente lineal de la siguiente manera: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% de B; 10min, 35% de B, 10,5 min, 35% de B, 14,5 min, 35% de B, 15 min, 85% de B, y 20 min, 85% de B. El caudal es de 0,15 ml / min de 0 a 10 min y 15 a 20 min, y 0,3 ml / min 10,5 a 14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparation de muestras de metabolitos <ol><li> Preparar un disolvente de extracción. Mezclar 40 ml de metanol (LC-MS grado) y 10 ml de agua (LC-MS de grado) en un tubo de 50 ml, y mantenerlo en -80 ° C congelador durante al menos 1 hora antes de su uso. Nota: Este procedimiento y los pasos siguientes pueden ser modificados para la extracción de los tejidos biológicos y muestras de fluidos. <ol><li> Cultura de colon HCT cáncer de 8 celdas de tres platos de 10 cm o placas de 6 pocillos con medio de cultivo completo RPMI 1640 suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino y 100 mil unidades / l de penicilina y 100 mg / l de estreptomicina. </li><li> Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, retire rápidamente el medio, y colocar el plato o plato encima de 13,15 hielo seco. Añadir 1 ml de disolvente de extracción inmediatamente (80% de metanol / agua), y transferir la placa a la -80 ° C congelador. Para un plato de 10 cm, añadir 3 ml de disolvente de extracción a cada pocillo. (Trate de eliminar el medio de tanto como sea posible para evitar el efecto de supresión de iones debido a las sales residuales del medio.)</li><li> Deje la placa durante 15 minutos. Retire del congelador, y raspar las células en el disolvente en hielo seco. Transferir la solución a 1,7 ml de tubos Eppendorf, y se centrifuga a la velocidad de 20.000 xga 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabolitos celulares de tres platos separados para hacer tres muestras replicadas. El propósito de mantener dos tubos es tener una como una copia de seguridad.) </li><li> Transferir el sobrenadante a dos nuevos tubos Eppendorf, y secarlos en el vacío la velocidad. Esto toma alrededor de 3-6 horas dependiendo de la velocidad de vacío utilizado. (Las muestras también se pueden secar durante la noche bajo gas nitrógeno.) </li><li> Después de tubos de secado, las tiendas de cada muestra en el -80 ° C congelador. Cuando esté listo, reconstituir una muestra en 20 ml de agua (LC-MS grado), e inyectar 5 ml de LC-QE-MS para el análisis. </li></ol></li></ol> 3. Configuración de la secuencia de muestras <ol><li> Una vez que la calibración se ha llevado a cabo correctamente en el QE-MS, LC equilibrar la columna durante 5 min con 85% A en un flujotasa de 0,15 ml / min, que es la condición de inicio de la gradiente de LC. </li><li> Establecer la secuencia de muestras en orden aleatorio. Nota: En este modo, se distribuye las fluctuaciones introducidas por el LC-MS a cada muestra y se asegura de comparación más precisa entre las diferentes muestras. Cada 6 muestras, añadir una carrera de lavado, que comparte el mismo método de MS, excepto el gradiente de LC es 95% de A durante 10 min y seguido de un equilibrado de la columna 5 min a 85% de A con una velocidad de flujo de 0,15 ml / min. Añadir muestras en blanco (100% de agua) después de cada carrera de lavado de evaluar el fondo del sistema y transferir los niveles. </li><li> Guarde la secuencia y una vez que la columna de la LC muestra la presión estable, en torno a 400 psi, comience la secuencia de ejecución. Si no hay otra muestra se debe ejecutar después de esta secuencia, a continuación, agregar una carrera parada en el final de la secuencia, que tiene un caudal de 0 ml / min en el final del degradado y seleccione &quot;modo de espera&quot; después de terminar el secuencia. </li><li> Vuelva a ejecutar el mismo conjunto de muestras de 12 horas después de la calibración. (Este is de evaluar la fluctuación de error en masa después de la calibración.) </li></ol> 4. Publicar Análisis de instrumentos de limpieza y mantenimiento <ol><li> Al final de la secuencia, lavar la columna con 95% de A a una velocidad de flujo de 0,2 ml / min durante 2 horas, y si es necesario, invertir la columna antes de lavar. </li><li> Retire la columna de la LC y conectar directamente el LC a la fuente de iones por un sindicato. Preparar disolvente de limpieza, / metanol / ácido fórmico agua (v: v: v, 90:10:0,2), configurar MS en el modo de espera, y sistema de lavado de LC-EM a una velocidad de flujo de 0,1 ml / min durante 1 h para eliminar el residuo precipitó sales u otras impurezas. Baje la velocidad de flujo si hay demasiada presión en el sistema. </li><li> Ajuste la temperatura del capilar a 50 º C, y quite la jaula de iones. Retire cuidadosamente el cono de barrido de iones y el tubo de transferencia de iones después de la temperatura del capilar se reduce a 50 ° C. Utilice una malla en bruto, tales como papel de lija, para eliminar las impurezas que quedan en la superficie del cono de barrido de iones. </li><li> Coloque la transferencia de ionestubo en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 10 ml de 90% de agua / metanol con ácido fórmico al 0,1%. Después de sonicación el tubo en un baño de ultrasonido de agua durante 20 minutos, se decanta el disolvente en el interior, reemplazarlo con 10 ml de metanol puro y someter a ultrasonidos durante otros 20 minutos. (Si es necesario, la sonicación se puede hacer a 40 ° C o una temperatura aún más alta para lograr mejores resultados de limpieza.) </li></ol> 5. Análisis de CL-EM de datos <ol><li> Para asegurar la secuencia de muestras se ejecuta sin problemas, después de terminar las dos primeras muestras de la secuencia, compruebe picos de metabolitos desconocidos. Utilice un archivo csv lista nombres de metabolitos, fórmula química neutral y modo de detección (ya sea positivo o negativo), como archivo de entrada y el archivo de salida contiene picos extraídos y error masivo en ppm. Si la forma del pico es anormal o el error de masas es apagado por más de 5 ppm, entonces el resto de la secuencia tiene que ser detenido y solución de problemas que hay que hacer. </li><li> Elija el método de la &quot;alineación picoy la extracción de fotograma &quot;en el software disponible en el mercado. Seleccione datos en bruto de LC-MS y los de grupo. Elige muestras en el medio de la secuencia de ejecución como muestra de referencia para el pico de cromatografía de alineación. Subir una semilla marco incluyendo metabolitos conocidos para el análisis de metabolitos apuntado con los datos recogidos y la semilla marco correspondiente. </li><li> Lleve a cabo el análisis de datos en modo positivo y negativo por separado. Utilice la configuración predeterminada para otros parámetros. Desactive la función de búsqueda de base de datos y ejecutar el flujo de trabajo. Exportar los datos tratados como una hoja de Excel que contiene el área del pico de cada cuadro. Los primeros conjuntos de marcos corresponden a los metabolitos en la lista de destino. Nota: Para un análisis de metabolitos dirigida, se obtiene la información de los metabolitos en base a los estudios previos 13,15. </li><li> Para un análisis de metabolitos no directo, elija el método de &quot;extracción de componentes&quot;. Cargue las muestras en blanco para la sustracción de fondo. Establecer pico de intensidad umbral de unt 10 5, ancho de m / z de 10 ppm y relación señal a ruido de 3. </li><li> Utilice la base de datos para la identificación humana metabolome compuestos desconocidos. Utilice un filtro de CV para eliminar los componentes con grandes CVs en muestras repetidas. Manualmente a través de cada componente y elegir aquellos con pico bien definido-o relativamente gran diferencia en diferentes tipos de muestras para la búsqueda de base de datos. Exportar datos con hits en la base de datos. (Alineación pico podría ser evitada si la puntuación pico alineación es demasiado baja.) </li></ol>

<ol>
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W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Los pasos más críticos para el metabolito de perfiles éxito en células utilizando este protocolo son: 1) controlar el medio de crecimiento y cuidadosa extracción de las células; 2) ajustar el método LC basado en configuración de métodos MS para asegurar que hay suficientes generalmente por lo menos 10) puntos de datos (a través de un pico para la cuantificación; 3) hacer una calibración de baja masa antes de ejecutar muestras; 4) la inyección de no más de 5 ml para evitar tiempo de retención desplazamient...

La metabolómica, definidas como un experimento que mide varios metabolitos simultáneamente, ha sido un área de intenso interés. La metabolómica proporciona una lectura directa de la fisiología molecular y ha proporcionado conocimientos sobre el desarrollo y la enfermedad como el cáncer de 1-4. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía de espectrometría de masas de gases (GC-MS) se encuentran entre los instrumentos más utilizados 5-9. RMN, especialmente se ha utilizado para los experimentos de flujo desde compuestos marcados de isótopos pesados, tales como 13 C etiquetados metabolitos, son RMN-activo 10,11. Sin embargo, esta estrategia requiere relativamente alta pureza de la muestra y la gran cantidad de la muestra, lo que limita sus aplicaciones en la metabolómica. Mientras tanto, los datos obtenidos de RMN análisis de las necesidades de obra y asignación compuesta de los espectros de RMN complejo es difícil. GC-MS ha sido ampliamente utilizado para los metabolitos polares y los estudios de lípidos, pero requiere compoun volátilds y, por tanto, a menudo la derivación de metabolitos, que a veces implica la química compleja que puede llevar mucho tiempo e introduce ruido experimental. La cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo utiliza el primer cuadrupolo para la selección de los iones primarios intactos, que son fragmentados a continuación, en el segundo cuadrupolo, mientras que el tercer cuadrupolo se utiliza para seleccionar fragmentos característicos o iones hija. Este método, que registra la transición de iones primarios a iones secundarios específicos, se denomina monitorización de reacción múltiple (MRM). MRM es un método muy sensible, específico y robusta tanto para moléculas pequeñas y cuantificación de proteínas 12-15,21. Sin embargo, MRM tiene sus limitaciones. Para lograr una alta especificidad de un método MRM tiene que ser construido para cada metabolito. Este método consiste en la identificación de un fragmento específico y la correspondiente energía de colisión optimizado, que requiere conocimiento previo de la propertes de los metabolitos de interés, como la información de la estructura química. Por lo tanto, con algunas excepciones que implican la pérdida neutra de fragmentos comunes, no es posible identificar metabolitos desconocidos con este método. En los últimos años, la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) instrumentos han sido puestos en libertad, tales como la serie LTQ-orbitrap y Exactive, el QuanTof y TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS pueden proporcionar una relación masa a carga (m / z) de los iones intactos dentro de un error de unas pocas ppm. Por lo tanto, un instrumento HRMS operado por la detección de todos los iones precursores (es decir, modo de barrido completo) puede obtener información estructural directa de la masa exacta y la composición elemental resultante del analito, y esta información puede ser utilizada para identificar los posibles metabolitos. De hecho, toda la información acerca de un compuesto se puede obtener con una masa exacta, hasta el nivel de los isómeros estructurales. Además, un completométodo de exploración no requiere conocimientos previos de los metabolitos y no requiere la optimización del método. Además, puesto que todos los iones con m / z caer en el rango de exploración pueden ser analizados, HRMS tiene una capacidad casi ilimitada en términos del número de metabolitos que pueden ser cuantificadas en un solo plazo en comparación con el método de MRM. HRMS también es comparable a un MRM de triple cuadrupolo de la capacidad cuantitativa debido al ciclo de trabajo corto que resulta en un número comparable de puntos de datos que se pueden obtener en un análisis completo de MS. Por lo tanto, HRMS proporciona un enfoque alternativo para la metabolómica cuantitativos. Recientemente, una versión mejorada de HRMS denomina espectrometría de masas Q-Exactive (QE-MS) se puede funcionar bajo la conmutación entre los modos positivos y negativos con tiempos de ciclo lo suficientemente rápido en un solo método, que amplía el rango de detección 19. Aquí describimos nuestra estrategia metabolómica utilizando el QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las actuales plataformas tienen diferentes factores limitantes, como las preparaciones de mano de obra de la muestra, bajos límites de detección, la velocidad de barrido lento, optimización de método intensivo para cada metabolito, y la imposibilidad de medir tanto positiva e iones con carga negativa en los experimentos individuales. Por lo tanto, un nuevo protocolo de la metabolómica podría avanzar los estudios de metabolómica. Cromatografía hidrófilo a base de amida permite el análisis de metabolitos polares sin ninguna derivatización química. MS de alta resolución usando el Q-Exactive (QE-MS) ha mejorado la óptica de iones, aumento de velocidades de exploración (256 ms a una resolución de 70.000), y tiene la capacidad de llevar a cabo el cambio positivo / negativo. Utilizando una estrategia de extracción de metanol frío y acoplar una columna de amida con QE-MS permite la detección robusta de 168 metabolitos y miles polares dirigidos de características adicionales de forma simultánea. Datun procesamiento se lleva a cabo con el software disponible comercialmente en una forma altamente eficiente, y características desconocidas extraídas de los espectros de masas se puede consultar en las bases de datos.

La exactitud de la metabolómica datos depende en gran medida del rendimiento del instrumento LC-QE-MS. Para evaluar si el instrumento está operando en buenas condiciones, y si el método aplicado es adecuada, varios picos LC metabolito conocido se extraen de la cromatografía de iones totales (TIC), como se muestra en la Figura 1. Metabolitos polares, incluyendo aminoácidos, productos intermedios de la glucólisis , intermedios TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADP + y así sucesivamente...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K vistas.  Cornell University.  Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución. 

Video: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Investigación

Biología

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Un método a gran escala para la cuantificación multiparamétrica del crecimiento de la levadura

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.