Agradecemos a nuestras fuentes de financiamiento Genome Canada y Genoma Québec, y la Universidad de Montreal, así como financiamiento de la Fundación Canadiense para la Innovación para la financiación de nuestro &quot;sinapsis con la enfermedad&quot; (S2D) del proyecto.

1. Selección de la enfermedad que puede ser causado por mutaciones de novo Una enfermedad que corresponde a los siguientes criterios pueden encajar con la hipótesis de la mutación de novo: <ol><li> La capacidad reproductiva se reduce. </li><li> La frecuencia de la enfermedad es relativamente alta y constante a pesar de muy diversos entornos. </li><li> La enfermedad se asocia con una mayor edad paterna. </li><li> El vínculo clásico y estudios de asociación no pudo explicar una fracción significativa de la heredabilidad de la enfermedad. </li><li> Los datos de concordancia de gemelos apoyar un modelo de novo. </li></ol> El análisis de la probabilidad de que una enfermedad común en mutaciones de novo puede explicar en parte la base genética es un primer paso crítico. 2. Selección de casos y muestras de ADN La selección de muestras adecuadas es fundamental para el éxito de la identificación de mutaciones de novo. Para maximizar las posibilidades de encontrar mutaciones de novo, se recomienda lo siguiente: <ol><li> Seleccionar los casos con la edad temprana de inicio, fenotipo grave, con los padres afectados, los padres mayores y no tienen antecedentes familiares prolongado de la enfermedad. </li><li> Elegir a los pacientes cuyo ADN disponibles son suficientes para realizar el estudio. Especialmente crítica es la disponibilidad de ADN de una fuente de células primarias que no fue objeto de cultivo (por ejemplo ADN de sangre o de ADN de saliva), </li><li> La disponibilidad de los padres del ADN es fundamental para determinar el estado de la transmisión de la mutación (heredado frente de novo). Disponibilidad de nuevos cohortes afectadas y los controles normales es necesario para los estudios de validación genética, una vez se identifican los genes candidatos. </li><li> Estimar el tamaño de la muestra sobre la base de la tasa de mutaciones, la cantidad de genes que se proyectarán y la estimación de la fracción de casos que pueden resultar de una mutación de novo. </li></ol> 3. Gene resecuenciación, dos enfoques principales <ol><li> De alta calidad secuencia de bajo rendimiento Este enfoque se basa en los genes candidatos enfoques. <ol><li> La selección de genes candidatos (s) Seleccionar el mejor candidato genes sobre la base de un sistema de puntuación que se basa en seis criterios principales. A continuación, calcular el total que corresponde a la suma de todos los puntos atribuidos con los seis criterios enumerados en la Tabla 1. Véase el ejemplo de nuestro proyecto en la figura 1 de la distribución seleccionado y no seleccionado los genes. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabla 1"/> Tabla 1. Criterios para la selección de genes candidatos <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Gráfico que muestra la distribución de los genes seleccionados y no seleccionado para la secuenciación de nuestro proyecto. Se obtuvo una distribución de genes entre los viajeros de propiedades candidato por los genes de clasificación de acuerdo a su valor en puntos. Por ejemplo, los genes y SHANK3 NRXN1, dos genes que hemos encontrado una mutación de novo, tenían una puntuación de 7 y 6, respectivamente (el máximo es 12). </li><li> Cartillas de diseño con Primers3 software a través de Exonprimer. Sólo la región de codificación y nudo de empalme deben ser cubiertos, incluyendo un extra de 50 pares de bases a cada lado del exón. </li><li> Optimizar las condiciones de PCR para la elección de Taq, el volumen de reacción, etc </li><li> Optimizar todos los fragmentos de PCR </li><li> Amplificar 5 ng de ADN genómico extraído de muestras de sangre de acuerdo a procedimientos estándar </li><li> Antes de enviar la secuencia, hacer control de calidad de sus productos PCR por la carga de un 2% en gel de agarosa. Seleccionaron al azar las muestras. </li><li> Secuencia de los productos de PCR en un analizador de ADN en una cadena. Un fragmento de la secuencia se considera con éxito si el análisis de más del 90% de las huellas es posible. Esto es aplicable para una proyección a gran escala. </li><li> Detección de variantes <ol><li> Utilice las herramientas para la detección y genotipificación de las variaciones genómicas como PolyPhred, Polyscan Surveyor y mutación. Una combinación de más de dos herramientas de detección es ideal. Por ejemplo, PolyPhred v.5 y v.6 PolyPhred con la configuración predeterminada no detectan las variaciones de lo mismo. V.3 Polyscan tiene una tasa de falsos positivos mutación mayor de SNPs (96%) y menos para el indeles (93%). PolyPhred v.6 no detecta la mayoría de los indeles cierto, pero tienen una tasa de falsos positivos de mutación (por indeles) inferior Polyscan general v.3 (90%). Debemos eliminar la opción de detección de SNPs para v.3 Polyscan y mantener ambas PolyPhred v.5 y v.6 PolyPhred para la detección de la variante. Surveyor mutación y Polyscan son mejores para la detección de indeles. Nota: La opción de detección de SNP no debe aplicarse cuando se utiliza Polyscan. Sólo el &quot;indel&quot; opción debe estar encendida. Polyscan generado a muchos falsos positivos para la detección de SNP. </li><li> Para cada uno nuevas variantes únicas exonic detectado, lo confirman de forma manual por reamplifying el fragmento y resequexperimentando el índice y los dos padres utilizando los cebadores atrás y hacia adelante para eliminar cualquier artefacto técnico. </li></ol></li></ol></li><li> Toda la secuencia exoma Este enfoque es una secuenciación de alto rendimiento dirigidos la mayoría de las regiones codificantes del genoma humano. Ahora estamos en la actualidad con este nuevo enfoque en el laboratorio, lo que acelera la detección de posibles genes candidatos. <ol><li> Pide el &quot;SureSelect Humanos Todos los Exon&quot; dirigidas a la región de codificación de más de 16.000 genes (50 MB del genoma), diseñado por Agilent o cualquier otro producto similar a otros como Roche. Antes de pedir el kit de captura, las plataformas de secuenciación debe determinar (Illumina vs sólido). </li><li> Hacer la captura de acuerdo con el protocolo de Agilent </li><li> Secuencia del producto en su respectiva disposición plataforma de próxima generación </li><li> Variante de la detección de toda la secuencia exoma: Varias herramientas bioinformáticas para la detección y genotipificación de las variaciones del genoma de la plataforma de secuenciación de última generación están disponibles, tales como ABM, bfast, Bioscope que llevará a cabo la alineación. Después de que otras herramientas de abajo libre disposición (por ejemplo, herramientas de SAM, Varscan, Annovar) sería necesario para llamar y anotar las variantes. Software comercial que incorpora la alineación de secuencias y llamando a la variante y la anotación también están disponibles como, NextGEN (Softgenetics), Bio CLC, y otros </li></ol></li></ol> 4. Variantes genómicas priorización Variantes identificadas se priorizan para el seguimiento de acuerdo a su probabilidad de ser de novo y son nocivos para la función de proteínas o de ARNm y / o estructura. La variante de seguimiento de las prioridades para la detección de la variante de novo debe ser como sigue: <ol><li> Variaciones únicas (como se observa, una vez en un solo caso) </li><li> Variaciones no están presentes en los padres </li><li> Proteínas truncar variaciones: un disparate, que lleva a indeles frameshift y mutaciones de empalme. </li><li> Variación de cambio de sentido y silenciosa prevé que sea funcionalmente perturbador (por ejemplo, afectan empalme del ARNm). Use PolyPhen, SIFT y PANTHER para efecto de predicción funcional de la proteína. </li></ol> Si se utiliza la secuencia exoma todo, la selección de genes candidatos puede ser utilizado como una estrategia para dar prioridad a las variantes en estudio. 5. Validación genética <ol><li> Volver a secuenciar el gen entero en casos de pacientes adicionales (para identificar otras mutaciones causantes) y en los controles. Las muestras de control se utilizarán para evaluar las frecuencias alélicas de las variantes de prioridad. Cualquier gen que contiene al menos dos diferentes mutaciones de novo nocivos (sin sentido, de empalme, marco de lectura, y predijo missense perjudiciales) en pacientes diferentes (pero no en las muestras de control o bases de datos públicas) debe ser de alta prioridad para los estudios de validación. Esto incluye: 1) las pruebas de un defecto de empalme potencial en líneas de células linfoblásticas derivadas de la paciente. En nuestra experiencia, la mayoría de los genes de rendimiento RT-PCR a partir de líneas de células linfoblásticas, 2) investigar los niveles alterados de expresión de la proteína por el análisis cuantitativo de Western blot de extractos de proteínas de las líneas de células linfoblásticas y 3) prueba más de la mutación / gen en el nivel funcional en animal (C. elegans, pez cebra) y los modelos de la línea celular como ya se ha hecho por nuestro grupo (por ejemplo: 5,6). </li></ol> 6. Los resultados representativos: Siguiendo este protocolo, hemos sido capaces de identificar nuevos genes de la esquizofrenia y el autismo. Un ejemplo es nuestra recientemente SHANK3 el descubrimiento de genes (Figura 2). Dos diferentes mutaciones de novo en el gen SHANK3, una mutación sin sentido en tres hermanos afectados y una mutación sin sentido en una mujer afectada. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) La segregación de la mutación sin sentido R1117X de tres hermanos afectados de la familia 419 PED. El índice es indicado por la flecha. (B) La segregación de la mutación missense R536W en el probando, pero no su hermano no afectado en 56 PED.

<ol>
	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

El procedimiento descrito aquí tiene como objetivo identificar determinadas enfermedades comunes que resultan probablemente, en parte, a partir de mutaciones de novo, y para probar esta hipótesis. Mutaciones de novo son un mecanismo bien establecido para el desarrollo de una serie de enfermedades, por ejemplo, los síndromes de cáncer hereditario, pero ha sido poco explorado en las enfermedades comunes. Esto a parte de los desafíos técnicos que participan en la identificación de mutaciones de novo, lo que requiere la secuenciación de grandes cantidades de ADN, que sólo muy recientemente rentable con la llegada de la Next Generation Sequencing. Además, la tasa de mutación de novo en los seres humanos era, hasta hace muy poco, sólo una estimación. Sólo muy recientemente se han producido informes que determinan directamente la tasa de mutación en los seres humanos. Antes de estas medidas, es difícil predecir el tamaño de muestra necesario para este tipo de estudio y para determinar si lo observado de la tasa de mutación de novo es mayor que la tasa de referencia. Secuenciación de genes candidatos en comparación con todo el genoma? Dado que la mayoría de las mutaciones de la enfermedad reportados son sin sentido / sin sentido y las mutaciones son mutaciones del sitio de empalme (de acuerdo al sitio web HGMD) nuestra estrategia de cribado se identifican más del 68% de las mutaciones conocidas. También hay una clara relación entre la gravedad de la sustitución de aminoácidos y la probabilidad de un fenotipo clínico. En comparación con una sustitución de aminoácido conservadora, un cambio de sentido es 9,0 veces más probabilidades de presentar síntomas clínicos 7. Por lo tanto, en este momento secuenciación de genes candidatos es la estrategia más rentable. El éxito del procedimiento descrito depende de varios pasos críticos, que se describen en detalle y se ilustra con dos ejemplos, el autismo y la esquizofrenia. Hay muchas trampas que deben evitarse, tales como la enfermedad de la que seleccionar, que los pacientes a la pantalla, la fuente de ADN, y los detalles de la forma de identificar de manera eficiente las mutaciones de novo. Ofrecemos un método más eficiente para la determinación de la fracción de casos de cualquier enfermedad que resulta de tales mutaciones espontáneas.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

Hay varias líneas de evidencia que apoya el papel de las mutaciones de novo, como mecanismo para enfermedades comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia. En primer lugar, la tasa de mutación de novo en los seres humanos es relativamente alta, por lo que nuevas mutaciones se generan en una alta frecuencia en la población. Sin embargo, mutaciones de novo no se han reportado en la mayoría de las enfermedades comunes. Las mutaciones en los genes que conducen a enfermedades graves donde existe una fuerte selección negativa contra el fenotipo, como la mortalidad en las fases embrionarias o la aptitud reproductiva reducida, no se transmitirá a varios miembros de la familia, y por lo tanto no será detectado por el mapeo de genes vinculación o asociación los estudios. La observación de concordancia muy alta en gemelos monocigóticos y la concordancia muy baja en los gemelos dicigóticos también apoya firmemente la hipótesis de que una fracción significativa de los casos puede ser consecuencia de nuevas mutaciones. Tal es el caso de enfermedades como el autismo y la esquizofrenia. En segundo lugar, a pesar de reducción de la aptitud reproductiva 1 y los factores ambientales extremadamente variable, la incidencia de algunas enfermedades se mantiene en todo el mundo a una velocidad relativamente alta y constante. Este es el caso del autismo y la esquizofrenia, con una incidencia de aproximadamente el 1% de todo el mundo. Carga mutacional puede ser considerado como un equilibrio entre la selección a favor o en contra de una mutación deletérea y su producción por una mutación de novo. Las menores tasas de reproducción constituyen un factor de selección negativa que se debe reducir el número de alelos mutantes en la población, en última instancia conduce a la prevalencia de la enfermedad disminuyó. Estas presiones selectivas tienden a ser de distinta intensidad en diferentes ambientes. Sin embargo, estos trastornos mentales graves se han mantenido en una constante prevalencia relativamente alta en la población de todo el mundo a través de una amplia gama de culturas y países a pesar de una fuerte selección negativa en contra de ellos dos. Esto no es lo que se podría predecir en enfermedades con capacidad de reproducción reducida, a menos que hubiera una alta tasa de mutación nueva. Finalmente, los efectos de la edad paterna: hay un aumento significativo del riesgo de la enfermedad con la edad paterna, lo que podría resultar del aumento relacionado con la edad paterna en mutaciones de novo. Este es el caso del autismo y la esquizofrenia 3. La relación hombre-mujer de la tasa de mutación se estima en aproximadamente 4-6:1, presumiblemente debido a un mayor número de divisiones de células germinales con la edad en los hombres. Por lo tanto, se podría predecir que mutaciones de novo que con mayor frecuencia provienen de los hombres, en particular los varones mayores 4. Una alta tasa de nuevas mutaciones podrían en parte explicar por qué los estudios genéticos no han logrado identificar muchos genes que predisponen a las enfermedades de los complejos de genes, como el autismo y la esquizofrenia, y por qué las enfermedades se han identificado sólo al 3% de los genes en el genoma humano . La identificación de mutaciones de novo como causa de una enfermedad requiere un enfoque específico molecular, que incluye a los padres y el estudio de los sujetos afectados. El proceso para determinar si la base genética de una enfermedad puede resultar, en parte, a partir de mutaciones de novo y el enfoque molecular para establecer este vínculo se ilustrará, con el autismo y la esquizofrenia como ejemplos.

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia at JoVE.com

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Estrategia de genética molecular para encontrar mutaciones de novo que causan enfermedades comunes tales como el autismo y la esquizofrenia.

Una estrategia para identificar mutaciones de novo en los trastornos comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K vistas.  Universite de Montreal. Estrategia de genética molecular para encontrar mutaciones de novo que causan enfermedades comunes tales como el autismo y la esquizofrenia.

Video: A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Investigación

Medicina

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

La<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Fotografía del fondo como una herramienta conveniente para estudiar las respuestas microvasculares a factores de riesgo cardiovascular en los estudios epidemiológicos

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

La inmunoterapia sublingual como alternativa para inducir protección contra las infecciones respiratorias agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesión quirúrgica del páncreas del ratón a través de la ligadura del conducto pancreático como un modelo para el endocrino y exocrino Reprogramación y proliferación

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

En Vivo Transferencia génica en el endotelio de la arteria carótida común conejo

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Un modelo Experimental del síndrome metabólico inducido por la dieta de conejo: consideraciones metodológicas, desarrollo y evaluación

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modelo de conejo de expresión del transgen Durable en la vena yugular a los injertos de interposición de la arteria carótida común

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...