Las células de la línea celular de condrosarcoma SW1353 fueron amablemente proporcionados por el Prof. Dr. PCW Hogendoorn y el Prof. Dr. J. Bovée de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Damos las gracias a J. Mestach y G. Wagemans excelente para la asistencia técnica y G. De Bruyne para el dibujo profesional de la información general de nuestro protocolo.

Ver Figura 1 para una visión general Material tumoral 1. Obtención y preparación de las muestras tumorales Para el uso de material del paciente, es necesario la aprobación del Comité de Ética y consentimiento informado tiene que ser obtenida del paciente. <ol><li> Material de cosecha representante (mínimo 1 cm 3) en el momento de la intervención, ya sea una biopsia o una resección de un sarcoma. El lugar adecuado de la biopsia se define utilizando dinámica de contraste de resonancia magnética. </li><li> Coloque el material inmediatamente en un vial estéril que contiene DMEM suplementado con 1.000 U de penicilina y 1 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Transporte el vial inmediatamente (30-90 min) al laboratorio. </li></ol> Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un flujo laminar. <ol start="4"><li> Verter el contenido del vial en una placa de Petri estéril. </li><li> Coloque la muestra de tumor en pequeñas partes de máximo 1 mm 3 utilizando un bisturí estéril. Retire todas las partes calcificadas ya que tienden a deteriorar aún más el procesamiento del tejido. </li><li> Tomar al azar 10 injertos tumorales para su aplicación en la CAM. </li></ol> 2. Preparación de derivados del tumor Suspensiones sola célula Duración aproximada: 3 horas <ol><li> Pesar el tejido restante de la muestra. </li><li> Ponga 2 - puede ser necesario 4 g de tejido en un tubo de disociador, más de un tubo de digerir todo el tejido tumoral restante. </li><li> Para la digestión de 2 - 4 g de tejido, añadir 2,5 ml de solución de colagenasa 2 (500 U / ml de RPMI 1640) y 2,5 ml de solución de DNasa (22 KU / ml de RPMI 1640). </li><li> Procesar el tejido de acuerdo con el protocolo h_tumor disociador. Esto implica 2 ciclos de incubación a 37 ° C en CO 2 incubadora mientras que el tubo se agita suavemente durante 30 min. </li><li> Se filtra la suspensión restante a través de un filtro de células de 150 micras. </li><li> Se centrifuga el lisado a 1.000 rpm durante 5 millasn. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 10 ml de tampón de lisis de eritrocitos (ELB), permitiendo 10 minutos de incubación con suspensión regular. </li></ol> Nota: tampón de lisis de los eritrocitos se fabrica de la siguiente manera: Añadir 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K 2 HPO 4, 8,29 g de NH4Cl a 1000 ml de agua, usar NaOH 10 N para ajustar el pH a 7,3, filtro bajo presión a través de unas 0,22 micras filtrar. Almacenar a 4 ° C. <ol start="9"><li> Añadir 25 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina) para detener la reacción. </li><li> Centrifugar la suspensión a 1000 rpm durante 5 min. El color de la pastilla debe ser blanco ahora. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 5 ml de medio a la pastilla. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Contar el número de células vivas / ml por medio de un contador de células automático. </li></ol> 3. CLíneas celulares Ancer SAOS2 células de osteosarcoma (número de registro ATCC: HTB-85) que expresan la proteína verde fluorescente se sometieron a electroporación por el vector pEGFP-C1 usando la Línea Celular Nucleofector Kit de V de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para establecer líneas celulares estables, las células transfectadas se seleccionaron en G418 (1 mg / ml) durante 4 semanas de acuerdo con el protocolo establecido anterior 20. Además clasificación se llevó a cabo por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células de la línea celular SW1353 condrosarcoma (número de registro ATCC: HTB-94) o suspensiones de células individuales tumorales recién preparados están etiquetados utilizando una membrana lipofílica fluorescente mancha roja. <ol><li> Retire las células del frasco de cultivo de una manera clásica usando tripsina (0,5% peso / volumen) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 0,2% en peso / vol) de solución. </li><li> Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Retire el supernatant. </li><li> Añadir 1 ml de medio libre de suero y 5 l Dil (Vybrant rojo) / 10 6 células. </li><li> Envuelva el vial en papel de aluminio y colocarlo en la incubadora de CO 2 durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 1000 rpm y eliminar el sobrenadante. </li></ol> Ensayo de membrana corioalantoidea 1. La incubación del huevo <ol><li> Se requieren huevos fertilizados de un criadero local comercial garantiza el 95% de fertilización de los huevos. </li><li> Los huevos fertilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta por 10 días. </li></ol> Nota: antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y excrementos se retiran cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por lavado en seco con toallas de papel, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con 70% de etanol desnaturalizado o cualquier otro reactivo de limpieza reduce significativamente la tasa de supervivencia de los embriones de pollo. <ol start="3"><li> Ponga los huevos en la incubator en un lado, marcando la superficie superior. El día en el que los huevos se ponen en la incubadora se designa 0 días de desarrollo embrionario. </li><li> Ajuste la temperatura de incubación a 37,8 º C, y la humedad al 47%. Asegúrese de que la opción de rotación automática está desactivada. </li></ol> 2. Apertura de los huevos Duración: ± 60 min para 25 huevos En el día 3 de desarrollo, los huevos se abren bajo flujo de aire laminar. Abrir los huevos en una etapa de desarrollo más resultados en daños a la CAM, como la membrana tiende a pegarse a la cáscara. Una lámpara de infrarrojos se utiliza para mantener los huevos calientes durante el procedimiento. Para mejorar la esterilidad, se recomienda el uso de guantes de la mano. <ol><li> Coloque el huevo en la huevera, con el lado marcado hacia arriba. </li><li> Bajar el nivel de la CAM mediante la eliminación de dos ml de albúmina a través de una aguja de 18 G insertado en la punta del huevo. Si la aguja no está afilada después de perforar varioscáscaras de huevo, cambiar la aguja. Si no es así, el exceso de fuerza tiene que ser ejercida, lo que podría dañar la yema de huevo o la fractura de la cáscara. A veces, la aguja está bloqueado por la chalaza, uno de 2 bandas espirales de suspensión de la yema en la albúmina. Esto se puede resolver, presionando suavemente el émbolo hacia abajo hasta que se resuelva el bloque. Si la yema de huevo es aspirado en la jeringa, reemplazar la aguja, así como la jeringa. A veces, el embrión muere después de este evento. Si se elimina una cantidad insuficiente de la albúmina, la CAM se daña cuando se quita la cáscara. </li><li> Aplicar una película adhesiva semipermeable en el lado superior marcada de la cáscara con el fin de evitar que se derrame de partículas de conchas en la CAM, mientras que el corte de la ventana. </li><li> Hacer un agujero de introducción con un punzón pequeño en la superficie del huevo. </li><li> Cortar una ventana de 1 cm 2 en el depósito, con un par de tijeras quirúrgicas puntiagudos estériles. </li><li> Corazón palpitante del embrión y vasos adyacentes se pueden observar en el thsuperficie e de la yema de huevo. Retire los huevos no fertilizados o embriones muertos. Un aspecto interrumpida de los vasos sanguíneos caracteriza embriones muertos. </li><li> Selle la ventana con una película adhesiva semipermeable. No es necesario para cubrir el sitio de punción, a menos que la cáscara se ha agrietado durante la inserción de la aguja. </li></ol> 3. Procedimiento de inoculación Duración: ± 1 hora por cada línea celular En el desarrollo de embriones de pollo día 9, los huevos se inoculan bajo flujo de aire laminar. Evaluación de las células de cáncer de difusión a través de la CAM requiere la contención de las células a una superficie limitada durante la inoculación. Matrigel es una matriz (ECM) de gel extracelular del sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm utilizado con frecuencia en condiciones de cultivo celular experimentales. Se trata de un líquido cuando se enfría, pero sufrirá polimerización térmicamente activado cuando se pone a 20 - 40 º C, formando de esta manera un gel estable. Durantelos experimentos, Matrigel se mantiene en una caja que contiene la fusión del hielo. Nota: Insistimos en no utilizar cubreobjetos perforadas. Se observó unión y el crecimiento de las células cancerosas injertadas en el disco de plástico de desviación por lo tanto el potencial de crecimiento de las células de la propia membrana. <ol><li> Resuspender el sedimento celular en gel de ECM enfriado a una concentración de 10 6 células/100 gel de ECM l. Mantener esta solución en la fusión del hielo. </li><li> Impuestos Especiales parte de la membrana semipermeable con un par de quirúrgica estéril bajo flujo de aire laminar. Si la película de adhesivo se elimina por completo, esto se traducirá en una mayor proporción de la muerte del embrión debido a la contaminación. </li><li> Toque la derecha CAM por debajo de la ventana de shell suavemente con una varilla de vidrio estéril, con el fin de eliminar la capa de células epiteliales. Tocar la CAM con una varilla de vidrio estéril demuestra ser menos traumática que el uso de un bisturí n º 11, que requiere más destreza y experiencia. Pueden producirse hemorragias pequeñas. </li><li> Ladding material tumoral. </li><li> Por injertos tumorales: baje suavemente una pieza de tejido en la CAM con un par de pinzas estériles, sin apretar. </li><li> Para el procedimiento de gel de ECM: 4x Añadir 25 l de la suspensión celular del gel-ECM a la CAM, en la parte superior de uno al otro, permitiendo que el gel de ECM para polimerizar entre las aplicaciones. De esta manera se crea una placa adherente que contiene las células cancerosas. </li><li> Selle la ventana del shell de nuevo con una película adhesiva semipermeable. </li></ol> 4. Imágenes y recolección de la CAM Duración: 2 horas para 25 huevos En el desarrollo de embriones de pollo 16 días, las CAM se cosechan. Trabajando bajo flujo de aire laminar no es necesario. <ol><li> Amplíe la ventana con un par de tijeras quirúrgicas. Asegúrese de no cortar demasiado, de lo contrario la CAM se dañará, lo que resulta en el sangrado de los vasos lesionados. </li><li> Agregar 300 - 500 l de PBS D con una pipeta sobre la secta CAMde iones que contiene el material inoculado. Si no se usan sondas fluorescentes, formaldehído tamponado puede ser utilizado como esto hace que la membrana más rígida, lo que facilita el corte de la membrana. </li><li> Hacer una fotografía de la CAM en el huevo a través de un microscopio de fluorescencia estéreo, equipado con una cámara digital en color, utilizando tanto la GFP o el filtro de DSR, y sin filtro. Para los injertos tumorales, todas las fotografías se toman sin filtros. Iluminación desde arriba por las luces LED se recomienda durante la fotografía (Figura 2). </li><li> Registro de migración de células tumorales de las células marcadas. Las fronteras de los tumores pueden ser irregulares y deshilachados. Células aisladas pueden estar presentes cerca de los límites del tumor. En algunas muestras, se pueden observar las filas de las células tumorales (Figura 3). </li><li> Cortar la membrana con un par de tijeras estériles en la frontera se extiende contra la cáscara. </li><li> Coloque la CAM recolectadas en una placa de Petri estéril llena con PBS D o tamponada paraformaldehído. </li><li> Hacer una fotografía de tanto el lado superior y el lado inferior de la CAM, con y sin filtro. </li><li> Colocar la membrana en un recipiente etiquetado con formaldehído tamponado durante al menos 72 horas. </li><li> Insertar las CAM en parafina y prepararlos para el examen histológico. Tener cuidado para cortar los injertos tumorales en el centro del nódulo, asegurándose de que la superficie de corte es paralelo a la parte inferior de la casete. Si no, la interacción entre la leva y el injerto del tumor no será visible. La misma estrategia se aplica a las placas de gel de ECM: la superficie que mira hacia la cuchilla de corte debe ser perpendicular a la placa. </li></ol> 5. Evaluación Histológica Tinción Hematoxilina-Eosina y Ki-67 inmunohistoquímica se realizaron para cualquier aclaración, si es necesario. La inmunohistoquímica se realizó sobre secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina de 3,5 m de espesor, utilizando una tinción de portaobjetos automatizada segúna las instrucciones del fabricante. Se utilizó un anticuerpo monoclonal primario de ratón para Ki-67 (clon MIB-1, dilución 1/100). El calor inducido por recuperación del epítopo se realizó mediante acondicionamiento de células 1, y la visualización se logró con el Kit de detección de DAB universal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deshidratación de las secciones de tejido se realizó utilizando un cubreobjetos automatizado. Para la las líneas de células SW1353 SAOS2 y, el número de células Ki67-positivo-negativo y Ki67 nuclei/100 2 micras fueron contados en tres zonas: una cerca de la frontera de la CAM, uno cerca de la superficie y uno en el centro de la placa de gel de ECM. Este procedimiento se repitió 6 veces para cada diapositiva Ki-67 manchado. El índice de proliferación se determinó para cada diapositiva dividiendo el número de células Ki67 positivas por el número total de células contadas. La necrosis se define por una pérdida de dispersión fina de la cromatina en el núcleo de la célula, acompañado por fading de márgenes distintos de células. Para xenoinjertos, la necrosis se anotó como completa, parcial (a menudo en la superficie), o está ausente. La infiltración de células tumorales en la CAM se define por la observación de las células tumorales en el mesodermo de la CAM, y se anotó como presente o ausente. Tres elementos se anotaron para el comportamiento del sistema. Infiltración de fibroblastos se define como células alargadas dejando la CAM e invadiendo el injerto / placa del tumor, y se anotó como presente o ausente. Crecimiento vascular se puede observar como crecimiento hacia el interior de la proliferación de los vasos de pollo, que se caracteriza por la presencia de eritrocitos de pollo nucleadas.

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Los autores tienen nada que revelar.

Tiempo de la inoculación y la cosecha Medir el tiempo del día de la inoculación se realizó utilizando SAOS2 en gel de ECM (36 CAMs) y varió entre el desarrollo embrionario días 5 y 10. Antes del día 9 de incubación, la CAM no fue siempre lo suficientemente grande para sostener el gel ECM se aplicó. En la cosecha, las células tumorales a veces tenían que ser recuperados de la CAM más profundo, y algunas muestras de gel ECM yacían sueltos en la albúmina ...

El sarcoma es un tumor poco frecuente de los tejidos conectivos con una alta mortalidad por 1,2 resistencia a la terapia. El progreso en la supervivencia del paciente se ve obstaculizada por su baja incidencia anual, su amplia diversidad, y el hecho de que las células del sarcoma son reportados a ser difícil de cultivo in vitro 3,4. El uso de células cultivadas para la evaluación de la terapia preclínica ha puesto de manifiesto que, aparentemente nuevas moléculas activas in vitro no siempre reflejan los resultados en el entorno clínico. Por otra parte, las aberraciones del genoma reveladas por las matrices de expresión génica no siempre son correlacionados con características de comportamiento del tumor en el paciente individual 5-7. Con el fin de tratar de resolver estos problemas, la medicina personalizada ha ganado en importancia, lo que se refleja en el aumento de búsqueda de modelos de xenoinjertos 8-12. Un ensayo in vivo tiene la ventaja de reflejar la compleja interacción entre cÁNCER células y el medio ambiente tejido del huésped en los tumores sólidos, que sean necesarias para la proliferación del cáncer y la invasión 13. Actualmente se estudia el uso de la prueba de la membrana corioalantoides (CAM-ensayo) como un modelo de xenotrasplante reproducible para el sarcoma 14,15. Este ensayo es ampliamente utilizado para el estudio de la angiogénesis tumoral 16,17. En la literatura, sin embargo, hemos encontrado diferentes protocolos para este ensayo, mientras que otros estudios se observó una marcada diferencia en el crecimiento o la angiogénesis de acuerdo con diferentes protocolos de 18,19. En este artículo se investiga el efecto de la variación de las condiciones del ensayo-CAM en el comportamiento celular mediante injertos tumorales, suspensiones de células individuales derivados del tumor y los cultivos celulares de sarcoma establecidos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

El sarcoma es una enfermedad muy rara que es de naturaleza heterogénea, todos obstaculicen el desarrollo de nuevos tratamientos. Pacientes con sarcomas son candidatos ideales para la medicina personalizada después de la estratificación, que explica el interés actual en el desarrollo de un modelo de xenotrasplante reproducible y de bajo costo para esta enfermedad. La membrana corioalantoidea de pollo es un anfitrión inmunodeficiente natural capaz de sostener los tejidos y las células injertadas sin restricciones específicas de la especie. Además, es de fácil acceso, manipulado y fotografiado usando microscopía estereoscópica óptica y de fluorescencia. Histología permite un análisis más detallado de las interacciones celulares heterotípicos. Este protocolo se describe en detalle la in ovo de injerto de la membrana corioalantoidea con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y la etiqueta fluorescente establecidos líneas celulares de sarcoma permanentes y transitorios (Saos-2 y SW1353). La rata de supervivencia de los pollueloses son hasta un 75%. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento. Para localizada injerto de suspensiones de células individuales, ECM gel proporciona ventajas significativas sobre los materiales inertes de contención. El índice de proliferación Ki67 se relaciona con la distancia de las células de la superficie de la CAM y la duración de la aplicación sobre la CAM, este último la determinación de un marco de tiempo para la adición de productos terapéuticos.

Evaluación de la CAM Injertos tumorales se vuelven adherentes a la CAM (Figura 2A). Suspensiones de células individuales de material del paciente con frecuencia muestran una placa ligeramente elevada seca (Figura 2D). Después de la escisión de la CAM, marcada arrugamiento de la membrana se produce (Figuras 2E y 2F). Para las líneas celulares comerciales la placa se hace más opaca en el tiempo,...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

La<em&gt; In ovo</em&gt; Membrana corioalantoidea (CAM) se injerta con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y estableció líneas celulares de sarcoma etiqueta fluorescente permanentes y transitorios. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento.

La<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K vistas.  Ghent University Hospital. La In ovo Membrana corioalantoidea (CAM) se injerta con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y estableció líneas celulares de sarcoma etiqueta fluorescente permanentes y transitorios. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una estrategia para identificar mutaciones de novo en los trastornos comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Investigación

Medicina

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Una guía sencilla Método de tornillo para intracraneal Estudios xenoinjerto en ratones

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

El glutamato y la hipoxia como un Modelo de estrés para el perfundido aislado Vertebrados Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

los<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Inyección de ácido oleico en cerdos como modelo de síndrome de dificultad respiratoria aguda

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...