Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01HL086939 (NCC).

En este protocolo se demuestra un hecho aislado y ventilado, la preparación de perfusión del pulmón de ratón que ha sido previamente utilizado para cuantificar el impacto de la embolia pulmonar y la hipoxia crónica sobre pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones (Tuchscherer, Webster, y Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). En resumen, los pulmones del ratón quirúrgicamente aislado de los tejidos circundantes, en una cámara climatizada (IL-1, Harvard Apparatus, Holliston, MA) y ventilado (módulo de control ventilatorio (VCM)-R con temporizador módulo contador (TCM), la Universidad de Harvard aparatos). La vasculatura pulmonar es perfundido con calefacción RPMI 1640 medio de cultivo celular con el 3,5% Ficoll utilizando una bomba de jeringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para generar las formas de onda de flujo estacionario o una bomba de alta frecuencia oscilatoria (Bose-Electro Fuerza, Eden Prairie, MN) en paralelo con la bomba de jeringa para crear formas de onda pulsátil del flujo vascular pulmonar. Transductores de presión (P75, Harvard Apparatus) medir la presión instantánea arteria pulmonar (PAP) y la presión de la aurícula izquierda (LAP). El caudal instantáneo (Q) se mide con un medidor de flujo en línea (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil de presión-flujo relaciones se derivan de estas mediciones, que dar una idea de la fisiología pulmonar vascular y la patología y la poscarga del ventrículo derecho. 1. Equipos: <ol><li> Pulmonar aislada, set-up incluyendo ventilador del ratón </li><li> Sistema de adquisición de datos y el ordenador con el programa LabView </li><li> Dos transductores de presión y caudal de flujo de perfusión </li><li> Transductor de presión y caudal (pnemotachometer) para el flujo de las vías respiratorias </li><li> De alta frecuencia oscilatoria de la bomba y el ordenador con el programa de prueba de Windows </li><li> Boom / zoom del microscopio, la lámpara </li><li> Calefacción baño con bomba de alto rendimiento para IL-1 </li></ol> 2. Preparación de la IL-1 <ol><li> El agua destilada calentada a 37 ° C por el baño de calentamiento se distribuye en el interior de la IL-1. </li><li> Todas las bombas, los transductores y la cánula de la IL-1 se conecta a través de la tubería limpia y todos los tubos se lava con agua destilada calentada a 37 ° C. Las burbujas de aire, que podría viajar a los pulmones y causan edema, debe ser eliminado. Tubo de la bomba de flujo oscilatorio en el sensor de flujo y del sensor de flujo a la cánula arterial pulmonar se lavan con PBS 1%. </li><li> El P75 transductores de presión se ponen a cero mediante el cierre de la válvula a la cánula, la apertura de las válvulas a la atmósfera y luego pulsar el botón automático de cero en el amplificador PLUGSYS. Entonces, la válvula a la atmósfera se cierra y se abre la válvula a la cánula. </li><li> La pieza de cerámica porosa en la vía de ventilación de la IL-1 se humedece para proporcionar la humedad. </li></ol> 3. Soluciones <ol><li> Prepare un 3,5% en volumen de Ficoll-RPMI solución de filtro estéril y los medios de comunicación. Filtrado de los medios de comunicación asegura que no hay partículas grandes que sin querer podría embolizar el pulmón. El uso de material estéril, también reduce la probabilidad de edema repentino en desarrollo en el pulmón. Llene una jeringa de 10 ml con RPMI para la cirugía y una jeringa de 60 ml con RPMI para cada ensayo experimental. Calentar la perfusión en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Prepare 1 ml de heparina de peso corporal 500IU/100g del ratón (aproximado). La sal de la heparina se 158IU/mg. Para un ratón ~ 25 g, mezcla de 1,25 mg de sal de heparina con 1 ml solución de PBS en un tubo de microcentrífuga pequeños. </li></ol> 4. Ventilación de un ratón <ol><li> Después de una inyección intraperitoneal de pentobarbital 150 mg en solución por kilogramo en el ratón, asegúrese de anestesia profunda mediante la realización de una pizca duro en una pata. Si no hay reacción, preparar el ratón para la cirugía por poniendo sus patas delanteras para panel de corcho para la estabilidad. Nota: A lo largo de la profundidad anestésica experimento se controla mediante una cuidadosa observación de los animales. Los pasadores en las patas y las incisiones con frecuencia actúan como estímulos nocivos, la falta de respuesta a lo que confirma que el animal permanece en un plano quirúrgico de anestesia. </li><li> Rocíe el pecho con un 95% de alcohol para humedecer la piel y el uso de fórceps directamente a agarrar la piel en el cuello. Un corte de 1 cm de abertura en la piel con las tijeras rectas. </li><li> Una vez que la parte interior del cuello está expuesto, eliminar todo el tejido glandular blanco y el músculo superficial, buscando el esófago y la tráquea. Aislar el esófago y la tráquea de los tejidos de ambos lados y hacia atrás. </li><li> Inserte la pinza pequeña inclinación en la tráquea y agarrar un pedazo de sutura en el otro lado. Tire de la sutura en la tráquea y corbata suelta el nudo cirujanos. No apriete la sutura o atar el nudo. </li><li> Corte un pequeño ángulo en &quot;V&quot; en la tráquea con unas tijeras pequeñas, no corte todo el camino a través de la tráquea. Mover el tablero de corcho y el ratón a la IL-1 se calienta el sistema. Usando las dos pinzas romas, toma de la cánula traqueal y la tráquea por debajo de la &quot;v&quot;. A continuación, deslice la cánula traqueal en la tráqueaea través de la &quot;v&quot; de apertura. Apriete la sutura alrededor de la tráquea y la cánula traqueal para asegurar la cánula en el interior de la tráquea. Atar el nudo. </li><li> Comenzar la ventilación (50% inspiración, 90 respiraciones / min, con la inspiración profunda) con el aire ambiente. </li></ol> 5. Perfusión de un ratón con ventilación 5.1. El acceso al ventrículo derecho para inyectar heparina <ol><li> Aspersión del ratón en el pecho con alcohol de nuevo para volver a humedecer la piel. Eliminar toda la piel en el pecho por encima de las costillas con las pinzas y tijeras rectas recta. Corte hacia arriba a lo largo del esternón. Levante la piel en cada lado y luego se corta la piel después de la línea de las costillas inferiores. </li><li> Comprender el proceso xifoides en la parte inferior del esternón con unas pinzas y un agujero en el diafragma con las tijeras rectas. Coge la membrana con las pinzas y cortar lejos de las costillas. </li><li> Comprender el proceso xifoides de nuevo con las pinzas (mano izquierda) y el uso de la punta de bola, ángulo tijeras para cortar el esternón y las costillas, teniendo cuidado de no cortar los pulmones, el corazón o los vasos sanguíneos (el uso del balón en la punta las tijeras que le guiará). Habrá sangre, pero siempre y cuando el filo de las tijeras es contra el esternón, el corazón y los pulmones no se corte. </li><li> Tome las costillas en el lado izquierdo y cortar la mayor cantidad de las costillas cuando sea necesario para exponer el corazón. Inyecte lentamente el ventrículo derecho con la solución 0,1 ml de heparina. Este paso es importante para prevenir los coágulos sanguíneos en el pulmón, que dañan las células endoteliales y poner en peligro la perfusión. La heparina debe ser inyectada, mientras el corazón sigue latiendo. </li></ol> 5.2. Canular la arteria pulmonar <ol><li> Cortar el resto de las costillas (lado izquierdo y derecho) utilizando la parte de atrás (redondeado) extremo de la pinza para empujar suavemente los pulmones de la pared torácica. Acaparamiento de los pulmones se puede dañar el delicado tejido. Contacto accidental entre las puntas de las tijeras y el tejido pulmonar también puede causar daños. </li><li> Mover el microscopio en su lugar sobre los pulmones. Cortar el tejido glandular y graso en la parte superior del corazón. Utilice las pinzas para tirar de las arterias y las venas y luego se corta con las tijeras de primavera, mientras que el tejido está en tensión. </li><li> Utilizando otro conjunto contundente de pinzas, pala de derecha a izquierda desde la parte superior del corazón en la aurícula izquierda / ventrículo para conseguir la punta de la pinza en la aorta y la arteria pulmonar (AP). Haga esto con cuidado, no debe haber resistencia a las pinzas. Utilizando unas pinzas romas reduce la probabilidad de accidente punción de la arteria pulmonar o la aorta. </li><li> Una vez que la punta de la pinza es en la aorta y la Autoridad Palestina, agarra un pedazo de sutura y salir adelante. Haga un nudo suelto cirujanos. No apriete la sutura o atar el nudo. </li><li> Opcional: utilizar las tijeras en ángulo para eliminar la mitad inferior del cuerpo. Cortar a lo largo de las costillas y la columna vertebral, el corte de la aorta y la vena cava causará una gran cantidad de sangre fluya - usar un Q-tip para detener el flujo. Coloque en una bolsa para su eliminación. </li><li> Primer PA cánula con 4 ml de una jeringa de 10 ml de RPMI. Compruebe que toda la tubería está libre de burbujas de aire. Perfusión del pulmón con agua destilada o burbujas se traducirá en edema. </li><li> Corte una muesca pequeña en la pared libre del ventrículo derecho e inserte la cánula PA, con el objetivo hacia abajo y hacia la derecha. La punta de la cánula debe ser visible a través de la pared transparente de la Autoridad Palestina. Infundir una pequeña cantidad de RPMI para confirmar el lugar. Apriete la sutura alrededor de la cánula, la aorta y la Autoridad Palestina y atar el nudo. Tenga en cuenta que en este punto, la aorta también se ligan para perfusión real no debe comenzar hasta la aurícula izquierda se canula. </li></ol> 5.3. Canular la aurícula izquierda <ol><li> Corte una muesca en la parte inferior del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda inerte cánula (LA), con el objetivo hacia arriba. Una ligera presión puede ser necesaria para abrir la válvula mitral en esta dirección. En la ubicación correcta, la punta de la cánula se desliza a través y ser seguro sin sutura. </li></ol> 5.4. Comenzar la perfusión <ol><li> Manualmente infundir RPMI de la jeringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto hasta que RMPI es evidente en la tubería de salida (de color rosa-ish color en contraste con la clara PBS). Si no hay flujo en la tubería de salida, vuelva a la posición de la cánula de Los Ángeles. Si no hay flujo de salida se puede obtener con el cambio de posición, compruebe si hay una fuga en la arteria pulmonar. Una fuga o un desgarro de la arteria pulmonar no se pueden reparar, lo que es motivo de abortar el experimento. </li><li> Conecte una jeringa de 60 ml a la cánula PA a través de la IL-1 e iniciar la infusión 1ml/min de perfusión, el control de fugas y asegurarse de que los pulmones se ponen blancos, lo que demuestra que RPMI es reemplazar la sangre en los pulmones. Perfundir con flujo lento durante dos minutos. </li></ol> 6. Medición pulsátil y constante del flujo pulmonar de presión Relaciones <ol><li> Para los estudios de flujo pulsátil, en primer lugar establecer el desplazamiento de la bomba de pistón oscilante enlos niveles deseados para cada frecuencia de la Wintest programa basado en experimentos anteriores. Variabilidad debida a la estructura pulmonar y la mecánica, los desplazamientos tienen que ser ajustados para cada ratón. Definir el flujo constante al nivel deseado. Abra la válvula a la bomba oscilatoria y empezar a registrar los datos antes de ejecutar el derecho de perfil de flujo oscilatorio (programa Wintest). Abra el archivo de datos y trazar el flujo experimental (Q) en Excel. Ajuste el desplazamiento de la bomba de pistón oscilante en cada frecuencia (programa Wintest) de modo que Q max y min Q son como se desee. </li><li> Para los ensayos de flujo constante, cierre la válvula a la bomba de oscilación. Si esta válvula se queda abierta, la bomba oscilante actúa como un condensador, amortiguando los cambios de velocidad de flujo a otro. Recoger datos durante al menos 10 segundos en cada velocidad de flujo o hasta que la presión de la AP no varía en más del 5%. </li><li> Para las mediciones de flujo pulsátil o sea estable, la ventilación de edad a una presión constante antes de la recolección de datos. Reanudar la ventilación inmediatamente después de la recolección de datos. </li><li> Esté atento a RPMI en el tubo de las vías respiratorias, lo cual es evidencia de edema y es motivo de abortar el experimento. También, no deje que RPMI alcanzar la presión de las vías respiratorias o el flujo de los sensores, ya que puede dañar los transductores. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Representante de resultados estables: En el pulmón aislado configurar el experimentador tiene la capacidad de controlar de forma independiente, no sólo el flujo pulmonar Q, sino también las vías respiratorias LAP presión P de aire y presión de la aurícula izquierda. Esto es ventajoso porque Q, P y LAP aire influyen en la vasculatura pulmonar y la consiguiente presión de la arteria pulmonar PAP. Otra ventaja es que los resultados obtenidos son independientes del tono del sistema nervioso simpático 1, el estado del volumen, y la anestesia 2. PAP cambios inducidos por los cambios de escalera-in-Q para el aire fijo P y ya sea fijo o variable LAP se muestra en la Figura 1. Tenga en cuenta que en la preparación de pulmón aislado, la cánula LAP suele estar conectado a un tubo que dirige la perfusión en un contenedor de residuos. Con este tubo en su lugar, LAP es linealmente dependiente, debido al flujo de Poiseuille Q. Sin embargo, la altura de la salida del contenedor de residuos y se puede ajustar manualmente para proporcionar una constante, no cero LAP o el tubo puede ser removido para permitir cero LAP que es independiente de Q. Representante Resultados pulsátil: Mientras que las formas de onda arbitraria flujo pulsátil se pueden generar con este sistema, que suelen generar flujo de la forma Q = 3 + 2 sen (2 f πt) ml / min en las frecuencias de f = 1, 2, 5, 10, 15 y 20 Hz para evaluar la impedancia lineal de la vasculatura pulmonar (Figura 2: panel superior). A partir de las mediciones resultantes PAP, LAP y Q, la magnitud de impedancia pulmonar vascular (Z) y la fase (θ) se calculan en primer lugar, la descomposición de un ciclo completo sinusoidal de DP = PAP-LAP y Q en cada impuesto frecuencia sinusoidal caudal en una serie de armónicos sinusoidales con una transformada de Fourier. La relación entre la presión de transformar el flujo de los rendimientos de transformar la impedancia pulmonar vascualar, PVZ = FFT (DP) / FFT (Q), que tiene una magnitud Z y la fase θ. Impedancia de entrada Z 0, impedancia característica Z C, y el índice de reflexión de la onda W R, se calcula a partir de la magnitud de la impedancia. En particular, Z 0 Z se calcula a partir de la 0 ª armónica (f = 0 Hz) entre todas las frecuencias, Z C se calcula como el promedio de Z entre el primer mínimo (5 Hz) y 20 Hz, y R W se calcula como (Z 0-Z C) / (Z 0 + Z C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Flujo constante de onda (fila superior) y las presiones resultantes. (Segunda fila: PAP, P aire, LAP) en función del tiempo con diferentes combinaciones de LAP y el aire P. La fila inferior muestra PAP vs P. En (A) y (B), aumenta y disminuye con la LAP Q debido a que el tubo de salida estaba en su lugar. Este tubo fue removido de (C) para que LAP es constante e independiente de P. En (D) y (E) de la altura de la tubería de salida se ajusta manualmente para que LAP es mayor, pero independiente de P. P aire, ya sea en final de la inspiración (A, C, D) o final de la espiración (B, E) de presión. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 flujo pulsátil de onda Q (panel superior) y las presiones resultantes (panel inferior: PAP, LAP y el aire P). En función del tiempo. A partir de estos pulsos de presión-flujo pulmonar relaciones, PVZ se puede calcular, lo que refleja el total de la poscarga del ventrículo derecho.

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+remodeling+in+isolated+mouse+lungs:+Effects+on+pulsatile+pressure-flow+relationships.">Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships.</a> Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).</li><li>Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs+for+the+Determination+of+Site+of+Action+of+Vasoactive+Agents+and+Disease.">Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease.</a> Ann Biomed Eng. , (2010).</li><li>Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+rho+kinase+inhibition+on+chronic+hypoxia-induced+changes+in+proximal+and+distal+pulmonary+arterial+structure+and+function.">Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function.</a> Journal of Applied Physiology. , (2010).</li><li>El-Bizri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+protein+22alpha-mediated+patchy+deletion+of+Bmpr1a+impairs+cardiac+contractility+but+protects+against+pulmonary+vascular+remodeling.">Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling.</a> Circ Res. 102, 380-388 (2008).</li><li>Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+invasive+and+noninvasive+approach+to+the+right+ventricle-pulmonary+circulation+unit:+state+of+the+art+and+clinical+and+research+implications.">Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications.</a> Circulation. 120, 992-1007 (2009).</li><li>Gan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+assessed+pulmonary+artery+stiffness+predicts+mortality+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 132, 1906-1912 (2007).</li><li>Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+pulmonary+arterial+capacitance+and+mortality+in+idiopathic+pulmonary+arterial+hypertension.">Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).</li><li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure.">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li></ol>

Pasos críticos en la operación Es muy importante que se tenga cuidado al cortar la caja torácica de los pulmones. Los pulmones deben estar totalmente expuesto y sin inhibiciones por los tejidos circundantes durante la inflación, pero no dañado durante el proceso de aislamiento. El uso de un objeto plano, como la parte de atrás de la pinza puede ser usado para mantener los pulmones de la pared del pecho para que no haya un camino claro para las tijeras para cortar. Otro paso fundamental es...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-829-10F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-823-2A </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>13-689-8 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI with GLN 6/PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>MT10040CV </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bottle Top Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>09-761-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll PM 70</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2878-100g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Y0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled Ball Iris scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14109-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15018-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Iris Scissors - straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14106-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont Medical Biology Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11254-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lauda E100 ECO-line 003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus </td>
<td>739904 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>730020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TS410 Flow Modules</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic </td>
<td>TS410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic</td>
<td>ME 4 PXN</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer </td>
<td>EW-74900-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amatheon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

Los aislados y ventilados y, instrumentado preparación de pulmón de ratón permite constante y pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones que se han medido con un control independiente sobre la tasa de flujo arterial pulmonar, de forma de onda de caudal, presión del aire y la presión de la aurícula izquierda. La resistencia vascular pulmonar se calcula sobre la base de múltiples puntos, constante flujo de la presión de curvas, la impedancia vascular pulmonar se calcula a partir de presión-flujo pulsátil curvas obtenidas en un rango de frecuencias. Como ahora se reconoce clínicamente, la impedancia es una medida superior de la poscarga del ventrículo derecho a la resistencia, ya que incluye los efectos de la distensibilidad vascular, que no son despreciables, sobre todo en la circulación pulmonar. Tres parámetros importantes de la impedancia - el cero hertz impedancia Z 0, la impedancia característica Z C, y el índice de reflexión de onda W R - proporcionar información sobre arterial distal área transversal disponible para el flujo, la rigidez arterial proximal y la impedancia aguas arriba y aguas abajo desajuste, respectivamente. Todos los resultados obtenidos en el aislamiento, ventilación y perfusión pulmonar es independiente del tono del sistema nervioso simpático, el estado del volumen y los efectos de la anestesia. Hemos utilizado esta técnica para cuantificar el impacto de la embolia pulmonar y la hipoxia crónica sobre la resistencia y la impedancia, y para diferenciar entre los sitios de acción (es decir, proximal frente a distal) de agentes vasoactivos y la enfermedad con la dependencia de la presión de Z C. Además, cuando se utilizan estas técnicas con los pulmones de cepas genéticamente modificadas de los ratones, los efectos a nivel molecular de defectos en la estructura vascular pulmonar y la función se puede determinar.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

El protocolo siguiente se describe el proceso de aislamiento, ventilación e instrumentación de los pulmones del ratón para medir constante o pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones con el fin de cuantificar los efectos del flujo sanguíneo, el flujo de aire, los cambios en las vías respiratorias y los cambios vasculares en la poscarga del ventrículo derecho.

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

characterization-isolated-ventilated-instrumented-mouse-lung-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K vistas.  University of Wisconsin – Madison. El protocolo siguiente se describe el proceso de aislamiento, ventilación e instrumentación de los pulmones del ratón para medir constante o pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones con el fin de cuantificar los efectos del flujo sanguíneo, el flujo de aire, los cambios en las vías respiratorias y los cambios vasculares en la poscarga del ventrículo derecho.

Video: Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Investigación

Biología

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein Transfection of Mouse Lung

Increasing protein expression enables researchers to better understand the functional role of that protein in regulating key biological processes1. In the lung, this has been achieved typically through genetic approaches that utilize transgenic mice2,3 or viral or non-viral vectors that elevate protein levels via increased gene expression4. Transgenic mice are costly and time-consuming to generate and the random insertion of a transgene or chronic gene expression can alter normal lung development and thus limit the utility of the model5. While conditional transgenics avert problems associated with chronic gene expression6, the reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) mice, which are used to generate conditional expression, develop spontaneous air space enlargement7. As with transgenics, the use of viral and non-viral vectors is expensive8 and can provoke dose-dependent inflammatory responses that confound results9 and hinder expression10. Moreover, the efficacy of repeated doses are limited by enhanced immune responses to the vector11,12. Researchers are developing adeno-associated viral (AAV) vectors that provoke less inflammation and have longer expression within the lung13.
Using &beta;-galactosidase, we present a method for rapidly and effectively increasing protein expression within the lung using a direct protein transfection technique. This protocol mixes a fixed amount of purified protein with 20 &mu;l of a lipid-based transfection reagent (Pro-Ject, Pierce Bio) to allow penetration into the lung tissue itself. The liposomal protein mixture is then injected into the lungs of the mice via the trachea using a microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). The microsprayer generates a fine plume of liquid aerosol throughout the lungs. Using the technique we have demonstrated uniform deposition of the injected protein throughout the airways and the alveoli of mice14. The lipid transfection technique allows the use of a small amount of protein to achieve effect. This limits the inflammatory response that otherwise would be provoked by high protein administration. Indeed, using this technique we published that we were able to significantly increase PP2A activity in the lung without affecting lung lavage cellularity15. Lung lavage cellularity taken 24 hr after challenge was comparable to controls (27&plusmn;4 control vs. 31&plusmn;5 albumin transfected; N=6 per group). Moreover, it increases protein levels without inducing lung developmental changes or architectural changes that can occur in transgenic models. However, the need for repeated administrations may make this technique less favorable for studies examining the effects of long-term increases in protein expression. This would be particularly true for proteins with short half-lives.

Transgenic mice or viral vectors have been used to increase protein expression within the lung. However, these techniques are time-consuming, technically challenging and have off-target effects that can confound results. Our protein transfection protocol uses a lipid based transfection reagent and an ultrafine microsprayer to uniformly deliver active protein to lung cells.

La transfección de proteínas de ratón de pulmón

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Función Fenotipificación ratón pulmonar<em&gt; En Vivo</em&gt; Con la capacidad de difusión pulmonar

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

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