Este proyecto fue financiado por el NIH / NCI número de concesión R00 CA127357 y la Universidad de Kansas Centro de Cáncer de Dotación.

1. El aislamiento y la extracción de colágeno de donantes de ratones C57BL/6J <ol><li> Sacrificio de los ratones normales madura mujer C57BL/6J utilizando métodos aprobados IACUC. </li><li> Cosecha de las colas y de inmersión en etanol al 70% durante 45 minutos para esterilizar tejidos. Seca la cola con papel de seda, envuelva en papel aluminio. Tienda de las colas de -20 ° C hasta que se necesite. </li><li> Coloque la cola en un ambiente estéril, como una campana de flujo laminar. Con la tijera, dividir la piel en la base de la cola y se desprenden de la cola. Quitar 0,5 a 1 cm de ambos extremos de la cola y se divide la cola restante en tres o cuatro piezas. Diseccionar los tendones de las colas y separar los tendones en fibras individuales utilizando una hoja de bisturí o navaja. </li><li> Transferencia de las fibras del tendón de un recipiente estéril y lavar con agua destilada estéril. Los tendones de transferencia de la cola de ratones 5-7 a un tubo cónico de 50 ml que contiene 35 ml de agua estéril desionizada agua que contiene 50 unidades / ml de penicilina penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina, y 0,034 N de ácido acético diluido una solución madre de ácido acético glacial (17 N). Lugar el rockero a 4 ° C durante una semana para extraer el colágeno. </li><li> Centrifugar los residuos en una centrífuga de mesa en 3000 g durante 15 minutos. Transferir el sobrenadante, aproximadamente 30 ml en dos tubos de policarbonato está adaptado para Beckman 50.2 Ti rotor y giran a 35.000 g (aproximadamente 17.000 rpm) durante 1 hora. </li><li> El volumen del sobrenadante tendrá que ser reducido para lograr una concentración de 1-2 mg / ml. Transferir el sobrenadante a una unidad de filtración Ultracel 50 k Amicon y girar en una centrífuga de mesa a 3000 rpm por 15 a 4 ° C. Transferir el filtrado a un tubo cónico estéril y guardar. Repetir la centrifugación hasta que el volumen se reduce a 6.5 ml. </li><li> Lea la concentración de proteínas. Nosotros usamos un estándar ensayo de Bradford (BioRad), utilizando BSA normas (BioRad) y las muestras sin diluir. Medir una muestra de su filtrado, como control negativo. </li><li> Posteriormente la pureza de la extracción mediante la resolución de una muestra de colágeno purificado en un gel de poliacrilamida al 6% SDS, 10 carriles, de 1,5 mm de espesor de gel. Prepare 20 mg de la muestra en 30 l de tampón de carga 1x SDS-PAGE que contiene 63 mM Tris HCl 10% de glicerol, 2% SDS 0,0025% de azul de bromofenol en 1,5 ml tubos Eppendorf. Prepare una cantidad equivalente de proteína de colágeno tipo I cola de rata como control positivo. Además, preparará un conjunto de normas de BSA en el 2,5, 5, 10, 20 mg diluidos en PBS 1X y el tampón de carga. Hervir las muestras a 95 ° C durante 5 minutos. </li><li> Deje que las muestras frescas y microfuga brevemente (la velocidad máxima durante 10 segundos) para hacer girar hacia abajo la condensación. </li><li> Cargar las muestras muestras junto con un marcador de peso molecular. Por ejemplo, carga de 5 l de estándar de la proteína Biorad Kaleidoscope. Electroforesis a 150 voltios durante aproximadamente 1 hora o hasta que el frente tinte llega al fondo. </li><li> Quitar el gel y tinción con Coomassie en buffer azul. Prepare el buffer mediante la mezcla de 2 g de azul de Coomassie, 75 ml de ácido acético glacial, 500 ml de etanol en un volumen total de 1000 ml que contiene agua desionizada. También hay que preparar la misma cantidad de tampón destain usando la receta, excepto sin reactivo Coomassie azul. Cubrir el gel con un volumen suficiente de azul de Coomassie y el lugar en una mecedora. </li><li> Roca lento durante 1 hora a temperatura ambiente y decantar la mancha. Sustituir la solución destain cuando se vuelve azul oscuro. Detener el gel durante la noche o hasta que las bandas individuales se resuelven en el gel. Busque dos bandas de colágeno (peso molecular = 90 kDa y 130) y tenga en cuenta la fuerza de las bandas en contra de las normas y los controles. Imagen del gel usando un sistema de gel doc, si es necesario. </li></ol> 2. Aislamiento y cultivo de las células del donante carcinoma de mama y fibroblastos de ratones C57BL/6J normales y PyVmT <ol><li> Edad sacrificio emparejado mujeres ratones transgénicos normal o PyVmT después de 10 semanas de edad cuando los tumores son evidentes y palpables en PyVmT ratones transgénicos utilizando métodos aprobados IACUC. </li><li> Exponer el ratón sobre la espalda en una superficie plana e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva. </li><li> Hacer una incisión en T invertida entre los pezones de la glándula mamaria torácica e inguinales y tirar de la solapa de piel para exponer las glándulas mamarias. Eliminar los tejidos mamarios y picar en trozos pequeños con unas tijeras quirúrgicas. </li><li> Preparar 100 ml de un cóctel de digestión enzimática que contiene: 200 mg de tripsina, 500 mg de colagenasa, 4 mg DNAsa, 100.000 unidades de hialuronidasa en PBS estéril y antibióticos durante la noche en hielo y luego de 3 horas a 37 ° C. </li><li> Añadir 10 ml de PBS con 10% de suero fetal bovino (SFB) a cada muestra y centrifugar el sedimento celular en una centrífuga de mesa a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspire con cuidado el sobrenadante y resuspender el botón celular en 5-7 ml de FBS% PBS/10. Repita el giro y lavar dos veces más. </li><li> Resuspender el botón celular en 10 ml de DMEM con 10% FBS contiene 50 unidades / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina en platos de 10 cm recubiertas con colágeno tipo I. Para las placas con capa de colágeno, el colágeno diluir 1 ml (con valores de 1,5 mg / ml) en 39 ml de 0,02 N de ácido acético diluido en agua destilada estéril o PBS. Pipetear 5 ml de solución de colágeno de trabajo en placas de 10 cm. Incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos. Aspirar el exceso de colágeno. Parafilm sin usar las placas y se almacenan a 4 ° C durante una semana. </li><li> Cambiar el soporte de 2 a 3 veces por semana. El éxito de la digestión de los tejidos se caracterizan por la presencia de focos epiteliales rodeada de husillo fibroblástica células en forma. </li><li> Separar los fibroblastos y las células epiteliales por tryspinization selectiva. Aspirar los medios de comunicación y se lavan las células con PBS una vez. Pipeta de 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA a las células y se incuban a temperatura ambiente. Los fibroblastos son más de baja adherencia de las células epiteliales. Compruebe si hay desprendimiento de fibroblastos en el microscopio después de 2 minutos, las células deben estar flotando en suspensión o detenidos, mientras que los focos epiteliales aún debe ser adherida a la superficie. </li><li> Golpee suavemente el plato para aflojar los fibroblastos y suavemente pipeta mls 10 de medio sin suero que contiene en el plato para eliminar los fibroblastos. </li><li> Pipeta de los medios que contienen fibroblastos de un tubo cónico de 15 ml y centrifugar como se describe en el paso 5). Replate estas células en colágeno recubiertas platos de 10 cm y repetir el proceso selectivo hasta tripsinización fibroblastos y células epiteliales están completamente separadas. </li><li> Comprobar la pureza de células por inmunofluorescencia para marcadores epiteliales tales como CK14 y CK18 y fibroblastos marcadores como la alfa actina de músculo liso (α-SMA). </li></ol> 3. La tinción de inmunofluorescencia de las células cultivadas <ol><li> Cubreobjetos de vidrio en lugar de 6 platos cm. Esterilizar por exposición a rayos UV durante 5 a 10 minutos en una campana de flujo laminar. </li><li> Cubra el cubreobjetos con 2.1 ml de solución de trabajo de valores de colágeno durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Aspirar exceso. </li><li> Trypsinize y la placa de 200.000 células epiteliales o los fibroblastos por muestra. Agregar 5.3 ml de medio completo y se incuba durante 24 horas. </li><li> Aspirar los medios de comunicación, lavar las células con PBS y se fijan en metanol helado a -20 ° C durante 7 minutos. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS para eliminar el etanol, y el bloqueo con 1-2 ml de PBS con 1% de SFB durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Con unas pinzas, retirar el cubreobjetos y colocarlo en un recipiente amplio y poco profundo cubierto con parafilm o superficie hidrofóbica otros. </li><li> Diluir los siguientes anticuerpos primarios 1:100 en solución de bloqueo: anti-actina de músculo liso (α-SMA, anti-CK14 (marcador epitelial basal), anti-CK18 (marcador epitelial luminal). </li><li> Pipetear 100 l de anticuerpos directamente sobre el cubreobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Incubar un cubreobjetos separadas de las células en solución de bloqueo, lo que muestra servirá como control de secundaria de anticuerpos. </li><li> Aspirar de anticuerpos y una pipeta de 1 ml de PBS directamente en el portaobjetos de lavar. Aspirar y repita 3-5 veces. </li><li> Diluir los siguientes anticuerpos secundaria en solución de bloqueo: anti-ratón Alexa 488 a 1:100, anti-ratón biotinilado a 1: 500, anti-ratón-alexa-568. </li><li> Envuelva el recipiente con el cubreobjetos en papel de aluminio. Pipetear 100 l de anticuerpo secundario apropiado directamente en el cubreobjetos: α-SMA con anti-ratón Alexa 568, CK 14 tinción con anti-ratón biotinilado y CK18 con el anti-ratón Alexa 488. Cubra el recipiente para proteger las muestras de la luz visible. </li><li> Aspirar anticuerpos y lavar con PBS como en el paso 9). Dejar las muestras en PBS, a excepción de tinción CK14. </li><li> Diluir estreptavidina conjugada con Alexa 568 1:500 en PBS. Se incuban las muestras teñidas con CK14 strepatividin-alexa 568 durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan con PBS como en el paso 9) </li><li> Diluir DAPI 1: 500 en PBS. Aspirar el PBS de las muestras y se incuban con DAPI durante 10 minutos RT en la oscuridad. </li><li> Enjuague las muestras con PBS. Pipetear 100 l de prolongar la anti-fade reactivo en portaobjetos de vidrio, a su vez el cubre más de lo que las células se enfrentan a la lámina de vidrio. Incline el cubreobjetos a un ángulo para hacer suavemente el contacto con los medios de comunicación de montaje. </li><li> Imagen de las muestras usando un microscopio de inmunofluorescencia. Mantener las muestras en la oscuridad para proteger la señal de inmunofluorescencia, que durará aproximadamente 2 semanas. </li></ol> 4. Preparación de las células de colágeno incorporados para el injerto <ol><li> Para integrar las células de colágeno, es necesario bajar el pH del colágeno para lograr la polimerización mediante la mezcla de colágeno con una solución de configuración. Prepare la solución de configuración mediante la mezcla de 100 ml de la solución de Earl 10 veces más de sal balanceada (EBSS) con 2,45 g de NaHCO3, 7,5 ml de NaOH 1 M y 42,5 ml de agua destilada estéril. Además esterilizar mediante un tapón de botella 0,22 micrones unidad conectada a un frasco estéril. </li> &lt;li&gt; Mezclar el colágeno (la concentración de las 1 mg / ml) con ajuste de la solución en un punto de partida 4: 1 relación. Para un injerto, mezclar 100 l de colágeno con 25 l de solución de configuración en un tubo eppendorf. Vortex brevemente o pipeta de la muestra arriba y abajo para mezclar perfectamente la muestra. </li><li> Añadir el colágeno o la solución de ajuste en incrementos de 5.10 l y mezcle bien hasta que el colorante rojo fenol en la mezcla cambia a una luz de color rosa a color naranja, lo que refleja un pH neutro. Un color amarillo indica un pH ácido, mientras que de color rosa oscuro refleja pH básico. Mantenga la mezcla en hielo para evitar la polimerización. </li><li> Eliminar los fibroblastos y las células epiteliales de la placa por tripsinización. En primer lugar, aspirar los medios de comunicación y lavar con 5 ml de PBS. Pipeta de 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA en HBSS por placa. Incubar los fibroblastos a temperatura ambiente durante 2-5 minutos. Se incuban las células epiteliales a 37 º C durante 2-6 minutos. Toque en las placas con cuidado para eliminar las células. Compruebe si hay desprendimiento con un microscope.Quench la tripsina pipeteando 9 ml de medio completo en el plato y la transferencia de las células a un tubo de 15 ml estéril cónica. </li><li> Sacar 50 ul y el recuento de las células por hemocitómetro. Tenga en cuenta el volumen total de células en cada tubo (10 ml). </li><li> Que sedimenten las células a 1500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el pellet de células y resuspender las células a una concentración de 100.000 células/100 l. Por ejemplo, volver a suspender las 500.000 células en un volumen total de 500 l de los medios de comunicación completa. </li><li> Mix 250.000 células del estroma (250 l) y 100.000 células tumorales (100 l) en un tubo separado. Microfuga 10 segundos a 1000 rpm, eliminar el sobrenadante con pipeta. Añadir 50 l de la solución de colágeno ajustarse a las células. Pipeta de arriba y abajo para dispersar las células por igual. Pipeta el l 50 en una placa estéril 6 cm de cultivo de tejidos para formar una gota circular. Incubar el injerto a 37 ° C durante 10 minutos para polimerizar. </li><li> Suavemente agregar 5 ml de medio completo en el plato por la inclinación de la placa en un ángulo y poco a poco pipetear los medios de comunicación por un lado de la placa. Incline la placa alrededor de los medios de comunicación hasta que cubre el injerto. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C. Trasplante inmediato. </li></ol> 5. Ortóptica trasplante de células de colágeno incorporados en ratones C57BL/6J <ol><li> Se fabrica una varilla de vidrio delgada para el trasplante. Caliente una pipeta Pasteur de vidrio con un mechero de Bunsen. Con unas pinzas, tramo final de la pipeta a 2.3 mm de espesor. Deje que se enfríe, y esterilizar en un 70% de etanol. </li><li> Esterilizar los instrumentos quirúrgicos siguientes en autoclave y etanol al 70%: multa tijeras quirúrgicas, contundentes tijeras quirúrgicas, pinzas romas, pinzas finas, clips de la herida, la herida de primera necesidad </li><li> Anestesiar el uso del ratón con un 2-3% isoflurano utilizando una máquina de isoflurano basura. El promedio de velocidad de flujo de O 2 se utiliza 1 L / min a través del cono de la nariz. </li><li> Coloque el ratón sobre la espalda e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva o extraíble. Quitar el pelo con un removedor de pelo químicos como Nair. Esterilizar el abdomen con un algodón limpiando, alternativamente, entre el 70% de etanol y betadine de una manera meta-like. </li><li> Sostener una parte de la piel por la glándula mamaria con fórceps romos con una mano. Con la otra mano, con contundentes tijeras quirúrgicas para realizar una T invertida-incisión entre el # 9 y # 10 pezones o # 4 y # 5 pezones de las glándulas mamarias inguinal para exponer las glándulas mamarias. </li><li> Haga una incisión en el bolsillo de los ganglios linfáticos o la arteria mamaria con pequeñas tijeras quirúrgicas de primavera. </li><li> Eliminar el injerto de colágeno de la placa de cultivo de tejido con las pinzas. Retire el exceso de líquido del injerto de colágeno suavemente frotando en una estéril limpiar y deslizar el injerto de colágeno por completo en el bolsillo con una varilla de vidrio delgada. </li><li> Suturar el colgajo de piel con suturas intestinales # 2 absorbibles o grapas de heridas. </li><li> Vamos a recuperar el ratón en la jaula. </li><li> Monitor de los ratones dos veces por semana como mínimo, la palpación de los tumores. Sacrificio de los ratones cuando los tumores alcanzan 1 cm de diámetro. Los tejidos de la cosecha para su análisis. </li></ol> 6. Los resultados representativos: El aislamiento y la extracción de colágeno a partir de ratones C57BL/6J Estos procedimientos han sido adaptados de 1. La extracción de la proteína del colágeno de la cola de ratón 5.7 rinde aproximadamente 1-1,5 mg / ml en un volumen final de 6 ml, o 6-9 mg de proteína. Por coommassie bandas mancha, que corresponde a 90 kDa y 130 se detectan en los carriles de carga con muestras extraídas de la cola de ratón, lo que indica la presencia de colágeno tipo I y colágeno pro-respectivamente (Figura 1). Aislamiento y cultivo de células de carcinoma de mama y fibroblastos de ratones C57BL/6J normales y PyVmT. Los procedimientos se han adaptado a partir del 2. Las células de carcinoma PyVmT y los fibroblastos se pueden distinguir por diferencias en la morfología celular y la expresión de determinados epiteliales y mesenquimales marKERS. Las células de carcinoma PyVmT se identifican por la forma de adoquines y co-expresar CK18, un marcador epitelial luminal y CK14, un marcador epitelial basal, pero no expresan α-SMA (Figura 2). Fibroblastos de mama son más grandes células con un fenotipo en forma de huso y expresan altos niveles de α-SMA, pero no expresan CK14 o CK 18 (Figura 2). Estos datos indican que más del 95% de pureza de células fibroblastos y células epiteliales utilizando los procedimientos descritos. Ortóptica trasplante de células de colágeno incorporados en ratones C57BL/6J Estos procedimientos han sido adaptados de 3, 4. Trasplante de ratones receptores son sacrificados cuando los tumores en los grupos experimentales llegar a 1,0 cm de diámetro, o aproximadamente 60 días. Aunque el trasplante de células PyVmT solo los resultados en los tumores palpables después de 30 a 40 días, alcanzando un peso promedio de 0,335 gramos del tumor a los 60 días, co-trasplante de células de carcinoma PyVmT con los resultados de los fibroblastos de mama en una masa tumoral medio de 0.630 gramos, lo que indica la mejora del crecimiento del tumor por los fibroblastos (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Análisis de tinción de Coomassie de colágeno tipo I de extracción de la cola de ratón. BSA (~ 66 kDa), está indicado por la flecha. Colágeno comerciales cola de rata (20 mg de proteína), y el colágeno purificado cola de ratón (20 mg de proteína) se indican con caja (~ 130 kDa, ~ 90 kDa proteínas). Std = estándar de peso molecular. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. La tinción de inmunofluorescencia de las células del donante PyVmT carcinoma de mama y fibroblastos. Paneles A y B representan PyVmT células de carcinoma de mama immunostained de anticuerpos para CK14 y CK18. Grupo C representa fibroblastos teñidos con anticuerpos α-SMA. Imágenes que se muestran con DAPI superposición de 20 aumentos. <img src="/files/ftp_upload/2716/2716fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. El desarrollo del tumor mamario en ratones C57BL/6J en la presencia o ausencia de los fibroblastos. Los tumores mamarios fueron recolectadas de ratones transplantados con células de carcinoma PyVmT en la presencia o ausencia de fibroblastos de mama y se pesa. Media ± error estándar de la media. N = 6 por grupo.

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	<li>Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+adult+human+prostatic+epithelium+and+rat+urogenital+sinus+mesenchyme+in+a+tissue+recombination+model.">Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model.</a> Differentiation. 63, 131-131 (1998).</li><li>Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Medina, D., Kittrell, F., Asch, B. B., Ip, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+as+mediators+of+solid+tumor+metastasis.">Immune cells as mediators of solid tumor metastasis.</a> Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).</li><li>Naito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+differentiation+and+function+in+health+and+disease.">Macrophage differentiation and function in health and disease.</a> Pathol Int. 58, 143-155 (2008).</li><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+cometh:+interplay+between+adaptive+immunity+and+cytokine+networks+in+rheumatoid+arthritis.">The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis.</a> J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).</li><li>Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Hepatocyte+Growth+Factor+Signaling+by+Type+II+Transforming+Growth+Factor-{beta}+Receptor+Knockout+Fibroblasts+Promotes+Mammary+Tumorigenesis.">Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).</li><li>Qiu, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+expression+profiling+identifies+signatures+of+tumor+virulence+in+MMTV-PyMT-transgenic+mice:+correlation+to+human+disease.">Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease.</a> Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).</li><li>Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+polyoma+middle+T+antigen+on+signaling+and+transformation:+A+DNA+tumor+virus+contribution+to+the+war+on+cancer.">Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer.</a> Virology. 384, 304-316 (2009).</li><li>Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+neural+cells+via+retrovirus-mediated+oncogene+transduction.">Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction.</a> Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).</li><li>O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+freshly+isolated+human+mammary+fibroblasts+and+endothelial+cells.">Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+mechanisms+of+human+cell+immortalization.">Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization.</a> Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).</li><li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis.">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li><li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus.">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li><li>Shen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+endothelial+cells+differentiated+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).</li><li>Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+propagation+of+yolk-sac-derived+endothelial+cells+from+a+hypervascular+transgenic+mouse+expressing+a+gain-of-function+fps/fes+proto-oncogene.">Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).</li><li>Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+non-invasive+single+marker+tracking+of+mammary+stem+cells+in+vivo+reveals+stem+cell+dynamics+throughout+pregnancy.">A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy.</a> PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).</li><li>Guzman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracarotid+injection+of+fluorescence+activated+cell-sorted+CD49d-positive+neural+stem+cells+improves+targeted+cell+delivery+and+behavior+after+stroke+in+a+mouse+stroke+model.">Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model.</a> Stroke. 39, 1300-1306 (2008).</li><li>Duda, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transplantability+of+tumor-associated+stromal+cells.">Differential transplantability of tumor-associated stromal cells.</a> Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).</li></ol>

Los experimentos con animales: Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el comité de IACUC de la Universidad de Kansas Medical Center.

La contribución funcional de los fibroblastos en la progresión tumoral se ha demostrado a través de modelos de trasplante, en el que el carcinoma de fibroblastos asociados co-trasplante con resultados benignos de mama células epiteliales en un mayor crecimiento del tumor y la invasión 5. Los enfoques convencionales de trasplante han involucrado el uso de ratones SCID o desnudo a las células de trasplante de co-estromales y epiteliales de diferentes orígenes genéticos del ratón o de diferentes especie...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> C57BL/6N ratones </td><td> Harlan </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> MMTV-PyVmT ratones transgénicos </td><td> Jackson laboratorios </td><td> 002374 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Pescador </td><td> SH3039603PR </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> VWR </td><td> 10000113873 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Pescador </td><td> MT-30-001 </td><td></td></tr><tr><td> anfotericina </td><td> pescador </td><td> BP2645-20 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon columnas de filtración Ultracel 50k </td><td> Millipore </td><td> UFC905008 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de rotor Beckman TI </td><td> Beckman </td><td> 355618 </td><td></td></tr><tr><td> Rata cola de colágeno </td><td> Pescador </td><td> CB 40236 </td><td></td></tr><tr><td> EBSS 10x </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7510-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina 1X, un 0,25% en HBSS w / o calcio y magnesio </td><td> Pescador </td><td> MT-25-050-CI </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Coomasie azul </td><td> Pescador </td><td> BP101 25 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T3924-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa A </td><td> Sigma AldrichC0130-50 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hyalronidase </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3884 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Kaleidoscope estándar de proteínas </td><td> Biorad </td><td> 1610375 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 12545-78 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> VWR </td><td> 101400-042 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentina anticuerpos S-20 </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> SC-7558 </td><td></td></tr><tr><td> α-actina de músculo liso </td><td> Abcam </td><td> ab5694 </td><td></td></tr><tr><td> CK14 anticuerpos </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> sc-53253 </td><td></td></tr><tr><td> CK18 anticuerpos </td><td> Abcam </td><td> ab668 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón biotinilado </td><td> Vector de laboratorios </td><td> BA9200 </td><td> Distribuido a través de Fisher </td></tr><tr><td> Anti-ratón-alexa-568 </td><td> Invitrogen </td><td> A10037 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11226 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P-36930 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 91400-12 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras finas primavera </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11002-12 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 pinzas finas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Intestino sutura crómica </td><td> Pescador </td><td> NC9326254 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 22-042-815 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pescador </td><td> A406P 4 </td><td></td></tr><tr><td> betadine </td><td> pescador </td><td> NC9386574 </td><td></td></tr><tr><td> Clips de la herida </td><td> Pescador </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Herida de primera necesidad </td><td> Pescador </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr></tbody></table>

mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in c57bl/6j mice

La influencia de las células del estroma, incluyendo los fibroblastos en la progresión del tumor de mama ha sido bien documentada a través de la utilización de modelos de ratón, en particular a través del trasplante de células del estroma y las células epiteliales en la glándula mamaria de ratones. Los modelos actuales del trasplante a menudo incluyen el uso de ratones inmunodeficientes, debido a los diferentes orígenes genéticos de las células del estroma y células epiteliales. Matrices extracelulares se utilizan a menudo para integrar los dos tipos diferentes de células de consistente interacciones célula-célula, sino que implican el uso de Matrigel o colágeno cola de rata, que son sustratos inmunogénica. La falta de funcionamiento las células T de ratones inmunodeficientes impide una evaluación precisa de las células del estroma en la progresión del tumor mamario en vivo, con importantes implicaciones en el desarrollo de fármacos y su eficacia. Por otra parte, los ratones inmunodeprimidos son costosos, difíciles de reproducir y requiere condiciones especiales de atención. Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado un método para el trasplante de células del estroma ortotópicamente y las células epiteliales en ratones a partir de los mismos antecedentes genéticos para inducir la formación de tumores consistente. Este sistema consiste en la recolección normal, carcinoma de los fibroblastos asociados, PyVmT células de carcinoma de mama y el colágeno de donantes ratones C57BL/6J. Las células son entonces integrados en el colágeno y trasplantados en las glándulas mamarias de las mujeres inguinal ratones C57BL/6J. El trasplante de células PyVmT hablar de formar tumores palpables 30-40 días después del trasplante. Análisis de seguridad de 60 días indica que la co-trasplante con los fibroblastos aumenta el crecimiento del tumor de mama en comparación con las células trasplantadas PyVmT solo. Mientras que las células y la matriz de ratones C57BL/6J fueron utilizados en estos estudios, el aislamiento de células y la matriz y el enfoque del trasplante puede ser aplicado a ratones de diferentes bases genéticas que demuestran la versatilidad. En resumen, este sistema puede ser usado para investigar las interacciones moleculares entre las células del estroma y las células epiteliales, y supera las limitaciones críticas en modelos de ratones inmunodeficientes.

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

En este informe, demuestran un sistema para aislar y cultivar células de donantes de la glándula mamaria de ratón, y ortotópicamente trasplante de estas células en ratones receptores para analizar estroma: interacciones epiteliales durante el desarrollo de tumores mamarios.

El trasplante de células del estroma mamario y células de carcinoma en los ratones C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

mammary-transplantation-stromal-cells-carcinoma-cells-c57bl6j

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K vistas.  University of Kansas Medical Center. En este informe, demuestran un sistema para aislar y cultivar células de donantes de la glándula mamaria de ratón, y ortotópicamente trasplante de estas células en ratones receptores para analizar estroma: interacciones epiteliales durante el desarrollo de tumores mamarios.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Investigación

Medicina

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Humanos mamaria interna arteria (IMA) de Trasplantes y colocación de un stent: un modelo humano para estudiar el desarrollo de la reestenosis intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Heterotópico cervical trasplante cardiaco en ratones

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...