Agradecemos al Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) por su generoso apoyo y supervisión de este trabajo y el Sr. Kieran Mellody (Universidad de Manchester, Manchester) para la edición crítica de este manuscrito. Este proyecto fue apoyado por la investigación del Reino Unido (CR-Reino Unido) el número de concesión C147/A6058 (AO)

1. Aislamiento de los principales cultivos fibroblastos humanos mamario normal Los procedimientos experimentales para aislar los fibroblastos humanos primarios cultivados mamario normal se describen en la figura. 1A. <ol><li> Prepare el buffer de disociación celular, como se describió anteriormente 12: Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FCS), penicilina-estreptomicina (200 unidades / ml), la colagenasa tipo I (1 mg / ml) y hialuronidasa ( 125 unidades / ml). </li><li> Lavar el tejido del seno disecados de una mamoplastia de reducción (~ 0.5 gramos) varias veces en tampón fosfato salino (PBS). Picar el tejido en pequeños fragmentos (&lt;1,5 mm 3) el uso de cuchillas de afeitar estéril. </li><li> La transferencia de los fragmentos de tejido en un tubo cónico de 15 ml que contiene una cantidad adecuada de lo anterior disociación celular de amortiguación (10 ml por cada 0,5 gramo de tejido) y agitar durante 1 minuto a máxima velocidad. </li><li> Digerir los fragmentos de tejido en el tampón de disociación celular fo 12-18 horas a 37 ° C con agitación lenta. * Tenga en cuenta que habrá todavía muchas piezas de fragmentos de tejido no se digiere queda en el tubo. </li><li> Incubar el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Transferir el resultado de células estromales enriquecido sobrenadante a un nuevo tubo cónico con una pipeta serológica de 5 ml. </li><li> Centrifugar la fracción del estroma durante 5 minutos a 250 x g y resuspender el pellet de células en PBS. Se centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 250 x g y resuspender el botón celular en DMEM suplementado con 10% FCS. Cultivar las células en DMEM con 10% FCS en una placa de Petri de 15 cm a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5%. </li><li> Se propagan las células hasta confluencia. Por lo general, se llevará a 8-10 días. Almacenar las células a -80 ° C con medio de congelación (10% dimetilsulfóxido y el 20% de FCS en DMEM). Prepare 5 viales congelados como un stock original. Descongelar un vial y expandir las células para preparar 5 viales de la población de secundaria que contienen fibroblastos pasajes de la población dentro de los 5duplicaciones (PD) para los experimentos posteriores. Estos procedimientos de selección clonal y minimizar el estrés cultural que pueden presentarse durante el cultivo de tejidos extendidos. * Tenga en cuenta que P1.1-7 también se puede utilizar para el aislamiento de los CAF de carcinomas de mama obtenida por una mastectomía 12. </li></ol> 2. Generación de buenas prácticas agrarias de etiquetado, puromicina resistente, inmortalizado fibroblastos humanos mamario normal <ol><li> Para inmortalizar la primaria fibroblastos humanos normales mamaria aislada en P1.7), introducir un retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) 12 vector, expresando hTERT y las buenas prácticas agrarias. Cultivar las células durante 4-5 días y luego ordenar las buenas prácticas agrarias de células positivas mediante citometría de flujo. </li><li> Introducir un retroviral pBabe-puro construcción que codifica un gen de resistencia a la puromicina fibroblastos inmortalizados GFP-etiquetados. Cultivar las células durante 5-7 días en presencia de puromicina (concentración final: 1 mg / ml) para aislar el GFP-positivo (GFP +), resistentes a la puromicina (puro R </sup&gt;) inmortalizado fibroblastos humanos mamarios. </li><li> A continuación, para examinar si estos fibroblastos producen los virus activos, lo que puede conducir a la transferencia horizontal de genes que codifican las buenas prácticas agrarias y la resistencia a la puromicina, crecer 2.5x10 5 GFP + puro R inmortalizado fibroblastos humanos de mama en una placa de Petri de 6 cm por 2 días. </li><li> Medio filtrante condicionada por estos fibroblastos utilizando un filtro de jeringa (tamaño de poro: 0,45 m) y agregarlo en 10T1 / 2 células de ratón fibroblastos de 12 horas en presencia de sulfato de protamina (5 mg / ml) que aumenta la eficiencia de la infección por el virus. El medio se cambió a 10% de FCS-DMEM de 2 días adicionales. </li><li> Se examinan las células mediante un microscopio de fluorescencia. 10T1 / 2 células infectadas por el virus de la GFP se convertirá en GFP-positivas. También tratar las células con puromicina (1 mg / ml) durante 5-7 días y observar la placa en su caso puro R 10T1 / 2 células están presentes y forman colonias después del tratamiento puromicina. </li><li> Tenga en cuenta que la transcripción de genes horizontalsfer por virus activo producido por la GFP los padres + puro R fibroblastos humanos mamarios pueden hacer las células que rodean murino y / o carcinoma de células GFP + R puro dentro de xenoinjertos de tumores. Esto puede dificultar el proceso de aislar el GFP inicialmente inyectado + puro R fibroblastos humanos mamaria de los xenoinjertos tumorales. </li></ol> 3a. La coinyección de los fibroblastos humanos mamaria con células de carcinoma de mama en un ratón inmunodeficiente Los procedimientos experimentales para la generación de exp-CAF se ilustra en la figura. 1Ba. <ol><li> Mezcla de 1x10 6 células MCF-7-ras las células humanas de carcinoma de mama y 3x10 6 GFP + R puro, inmortalizado fibroblastos humanos mamarios generados en P2.2). Prepare las células en 400 l de medio de cultivo con 50% (v / v) Matrigel por inyección. </li><li> Inyectar la mezcla de células por vía subcutánea en un ratón desnudo inmunodeficientes. Cuando los CAF son extraídos de forma independiente a partir de diferentestumores, implantes cada mezcla en los flancos derecho e izquierdo de varios ratones. </li></ol> 3b. La inyección de fibroblastos humanos de mama en un ratón inmunodeficiente <ol><li> Para generar los fibroblastos de control contra la exp-CAF, preparar 3x10 6 GFP + puro R inmortalizado fibroblastos humanos mamarios generados en P2.2 en 400 l de medio de cultivo con 50% (v / v) Matrigel por inyección (Fig. 1Bb). No mezcle los fibroblastos con las células de carcinoma. </li><li> Implante de los fibroblastos preparado en P3b.1 en sitios subcutáneos de ratones desnudos. </li></ol> * Tenga en cuenta que los fibroblastos inoculados se forma el tejido fibroblástico del tumor, pero no debajo de la piel. 4a. La disección de xenoinjertos de tumores <ol><li> Eutanasia del ratón alberga un subcutánea de mama humano xenoinjertos de cáncer 42 días después de la implantación (Fig. 1Ba). * Nota que cuando las células de carcinoma y / o fibroblastos son coimplanted, Los fibroblastos pueden necesitar ser incubadas durante más de 42 días dentro de los xenoinjertos tumorales para iniciar su fenotipo miofibroblastos. </li><li> Cosecha del xenoinjerto tumoral en el flanco del ratón mediante disección roma con pinzas y tijeras. Sumergir el tejido del tumor en PBS. </li></ol> 4b. La disección de xenoinjerto de fibroblastos <ol><li> La eutanasia a los ratones que albergan el xenoinjerto de fibroblastos 42 días después de la implantación (Fig. 1Bb). </li><li> Diseccionar el xenoinjerto de fibroblastos subcutáneos con pinzas y tijeras. Coloque el tejido fibroblástico en PBS. * Tenga en cuenta que un xenoinjerto de fibroblastos, que aparece como un tejido transparente pequeño, puede ser difícil de encontrar debajo de la piel. </li></ol> 5. Preparación de los principales cultivos de células de xenoinjertos <ol><li> Utilice un gabinete de bioseguridad estéril para disecar el tumor (~ 0.5 gramos) o tejido fibroblástico (~ 0,1 gramos). La transferencia de los tejidos extirpados en la parte superior de una cultura d 15 cmISH con 1 ml de PBS. Picar los tejidos en fragmentos de tejido pequeños (&lt;1,5 mm 3) el uso de cuchillas de afeitar estéril. * Tenga en cuenta que si los xenoinjertos de fibroblastos pesa menos de 0,1 gramos, se recoge una xenoinjertos algunos adicionales de fibroblastos y mezclarlos entre sí para aumentar el número de células para el aislamiento. </li><li> La transferencia de los fragmentos de tejido en un tubo cónico de 15 ml que contiene la celda de disociación de amortiguación (10 ml por cada 0,5 gramo de tejido) y agitar durante 1 minuto a máxima velocidad. </li><li> Incubar la suspensión celular durante 3 horas a 37 ° C con agitación lenta continua. </li></ol> 6. El aislamiento de las células resistentes a la puromicina en la cultura <ol><li> Se centrifuga la suspensión celular disociada tanto de xenoinjerto de tumor o de fibroblastos durante 5 minutos a 250 x g y resuspender el botón celular en PBS. Se centrifuga de nuevo durante 5 minutos a 250 x g. Resuspender el pellet de células resultantes en el 10% FCS-DMEM. Cultivar las células en una placa de Petri de 15 cm en la presencia de puromicina (1 mg / ml) a 37 ° Cy el 5% de dióxido de carbono con el fin de eliminar las células carcinoma contaminantes y / o murino las células del estroma. Se propagan las células hasta confluencia (2-4 semanas). Almacenar las células a -80 ° C con medio de congelación. * Tenga en cuenta que el resultado puro células R, designado de 42 días de edad, exp-CAF1 (Fig. 1Ba) o el control de fibroblastos-1 en las células (Fig. 1Bb), son inmortales y positivo para las buenas prácticas agrarias. Se recomienda comprobar si estas células producen los virus activos con 10T1 / 2 células, como se describe en P2.3-6. </li></ol> 7a. El aislamiento de células CaF2 exp-en la cultura Para potenciar aún más el fenotipo activado miofibroblástico de CAF, mezcla de los 42 días de edad CAF1 exp-células con células MCF-7-ras las células y se inyectan de nuevo por vía subcutánea en un ratón desnudo por períodos adicionales de 200 días. Diseccionar y disociar los xenoinjertos de tumores en una suspensión de un solo cultivo de células y las células en una placa de Petri de 15 cm con 10% FCS-DMEM en presencia de puromicina (1 mg / ml), como se indica en P60.1. Se propagan las células hasta confluencia (8-10 días). Almacenar las células a -80 ° C con medio de congelación. El resultado de puro R células se llaman 242 días de edad CaF2 exp-células (Fig. 1Ba). 7b. Extracción de control 2 de fibroblastos-células en cultivo Para generar los fibroblastos de control contra la exp-CaF2 las células, se inyectan de 42 días de edad, el control de los fibroblastos-1 células por sí solas, sin células de carcinoma por vía subcutánea en un ratón desnudo, además, durante 200 días. Diseccionar y disociar el tejido fibroblástico en una suspensión de células individuales y la cultura de las células en una placa de Petri de 15 cm con 10% FCS-DMEM en presencia de puromicina (1 mg / ml) como se indica en P6.1. Se propagan las células hasta confluencia (3-4 semanas). Almacenar las células a -80 ° C con medio de congelación. El resultado de puro R se llaman las células de fibroblastos-2 de control de las células (Fig. 1Bb). 8. Los resultados representativos: Control de los fibroblastos-2 y cel exp-CaF2ls, que han sido extraídos de xenoinjertos de tumores de mama, teñidas fuertemente positivo para los marcadores mesenquimales, incluyendo humanos específicos de vimentina, propil-4-hidroxilasa, 1A colágeno, fibronectina, S100A4, y la proteína de superficie de fibroblastos (Fig. 2A) 11, lo que indica humanos origen y la naturaleza mesenquimal de las células. En contraste, la citoqueratina, un marcador para las células epiteliales, no era una mancha en estos GFP + fibroblastos (Fig. 2B). Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la extrae CaF2 exp-2 y el control de fibroblastos-células tienen su origen en la de sus padres fibroblastos humanos mamarios se introdujo inicialmente en xenoinjertos de ratón. Es importante destacar que una mayor proporción de CaF2 exp-células teñidas positiva para α-SMA y la glicoproteína de la matriz extracelular tenascina C 5, los cuales son marcadores de miofibroblastos en comparación con 42 días de edad, exp-CAF1 y el control de dos fibroblastos (Fig. . 2C, D) 11. Estos datos indican que FIBR residente de mama humanoprovincias evolución progresiva en miofibroblastos CAF en xenoinjertos de tumores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" /> Figura 1 Representación esquemática de aislamiento de los fibroblastos humanos mamarios. A) El tejido de la mamoplastia de reducción fue picada con hojas de afeitar estériles (P1.2) y se transfiere a un tubo cónico de 15 ml (P1.3). Los pequeños fragmentos de tejido fueron digeridas en la celda de la disociación de amortiguación (P1.4) y preparado para el cultivo in vitro (P1.5-7). Para inmortalizar los aislados primarios de fibroblastos humanos de mama, una pMIG retroviral (MSCV-IRES-GFP), vector, expresando hTERT y las buenas prácticas agrarias, se introdujo, y la GFP-con resultados positivos las células fueron ordenados mediante citometría de flujo (P2.1). Un retroviral pBabe-puro vector que codifica un gen de resistencia a la puromicina fue introducido en estas células. Tras el tratamiento puromicina, GFP-etiquetados (GFP +) resistentes a la puromicina (Puro R), immortalised de mama fibroblastos humanos fueron aislados (P2.2). Ba) Para generar exp-CAF, GFP + puro R inmortalizado fibroblastos humanos coinjected mamaria con células MCF-7-ras células de carcinoma de mama por vía subcutánea en un ratón inmunodeficiente desnuda (P3a). El xenoinjerto de tumor fue resecado a los 42 días después de la implantación (P4a) y se disocia en una suspensión de una sola célula (P5). Estas células fueron cultivadas in vitro en presencia de puromicina para eliminar las células carcinoma de células de ratón y la contaminación del estroma (P6). El resultado resistentes a la puromicina células se denomina experimental generada CAF1 (exp-CAF1) las células. Estas células, resecado 42 días post-implantación, una vez más se mezclan con células MCF-7-ras y se implantaron subcutáneamente células en un ratón de acogida como antes (P7A). El tumor resultante se dejó crecer por períodos adicionales de 200 días, diseca, disociados, y se cultivan en presencia de puromicina. El aisladopuromicina resistentes a las células se denominan células CaF2 exp (242 días de edad). Bb) Para aislar las células de control contra la exp-CAF, GFP + puro R inmortalizado fibroblastos humanos mamarios fueron inyectados por vía subcutánea en un ratón desnudo como cultivos puros sin MCF-7-ras células (P3b). El tejido fibroblástico, disecados 42 días post-implantación (P4B), se disocia en una sola célula suspensiones (P5) y las células resistentes a la puromicina, llamado control de fibroblastos-1 en las células, fueron aislados como se describió anteriormente (P6). Estos fibroblastos fueron una vez más implantados subcutáneamente en un ratón desnudo sin MCF-7-ras las células, además de 200 días (P7b). El tejido fibroblástico fue disecada, disociados, y se cultivan en presencia de puromicina. El aislado puromicina resistentes a las células fueron llamados fibroblastos-2 de control de las células (242 días de edad). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" /> Figura 2 <stRong&gt; Exp-CAF y el control de los fibroblastos se originan en la de sus padres fibroblastos de mama humano. (A) los análisis de inmunofluorescencia de control de fibroblastos-2 (control de f.) y las células CaF2 exp. Los tipos de células tanto tinción positiva para marcadores mesenquimales (rojo), incluidos los humanos vimentina, prolil-4-hidroxilasa, 1A colágeno, fibronectina, S100A4, y proteína de la superficie de fibroblastos. (B) Por el contrario, pan-citoqueratina, un marcador para las células epiteliales , no se detecta en CaF2 exp-las células que expresan GFP (verde). Los núcleos celulares se tiñen con 4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). Barra de escala, de 50 micras (denominadas de Kojima et al. 11) (C) Inmunofluorescencia de CaF2 exp las células y el control de dos fibroblastos (control f.) usando anticuerpos contra la α-SMA (rojo) o la tenascina C (TN-C) (rojo). Núcleos de las células se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala, de 50 micras. (D) 48% de CaF2 exp células tinción positiva para α-SMA, mientras que un4% de los 42 días de edad, exp-CAF1 y el 2,5% de la población de células de fibroblastos de control 2-son positivas para α-SMA. (Denominados de Kojima et al.11)

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No hay conflictos de interés declarado.

La falta de marcadores específicos de la CAF y el nivel de heterogeneidad observada entre CAF hacer la caracterización de este tipo de células por sí un desafío. CAF estudiar in vitro también se ha visto obstaculizado por la complicación adicional de que estas células envejecen y dejan de proliferar en cultivo durante un largo período. Nuestro intento anterior para inmortalizar directamente CAF primario utilizando un retrovirus construir hTERT cDNA no tuvo éxito. Por lo tanto, a investigar más a fond...

<table border="1"><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> DMEM </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 61965-026 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino </td><td></td><td> GIBCO </td><td> 10270 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td></td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa tipo I </td><td></td><td> Sigma </td><td> C0130-1G </td><td></td></tr><tr><td> hialuronidasa </td><td></td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Vimentina (V9) de anticuerpos </td><td></td><td> Novocastra Laboratorios </td><td> NCL-L- VIM-V9 </td><td></td></tr><tr><td> Tenascina C (AC-8) de anticuerpos </td><td></td><td></td><td></td><td> un regalo de Dr. <strong&gt; Luciano Zardi </td></tr><tr><td> α-SMA-Cy3 (1A4) de anticuerpos </td><td></td><td> Sigma </td><td> C6198 </td><td></td></tr><tr><td> Prolil-4-hidroxilasa </td><td></td><td> Dako </td><td> M0877 </td><td></td></tr><tr><td> (5B5) de anticuerpos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> El colágeno tipo 1 1A anticuerpos </td><td></td><td> Sigma </td><td> HPA011795 </td><td></td></tr><tr><td> Pan-citoqueratina de anticuerpos </td><td></td><td> Sigma </td><td> C5992 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpo de fibronectina </td><td></td><td> BD Biosciences </td><td> 610077 </td><td></td></tr><tr><td> S100A4/FSP-1 (fibroblastos proteína-1 específicos) de anticuerpos </td><td></td><td> Dako </td><td> A5114 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblastos proteína de la superficie (Clon 1B10) de anticuerpos </td><td></td><td> Abcam </td><td> ab11333 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> MSCV-IRES-GFP construir </td><td></td><td></td><td></td><td> Solicitud a los autores de la </td></tr><tr><td> pBabe-puro construir </td><td></td><td></td><td></td><td> Compra de Addgene </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td></td><td> Sigma </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td></td><td> Sigma </td><td> D9564 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo cónico de 15 ml </td><td></td><td> Corning </td><td> 430766 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón desnudo </td><td></td><td> Taconic </td><td> NCRNU-F </td><td> Mujer desnuda NCR </td></tr><tr><td> C3H/10T1/2 células </td><td></td><td> ATCC </td><td></td><td> CCL-226 </td></tr></table>

experimental generation of carcinoma-associated fibroblasts (cafs) from human mammary fibroblasts

Los carcinomas son los tejidos complejo compuesto por células neoplásicas y un compartimento no canceroso conocido como el &quot;estroma&quot;. El estroma está formado por la matriz extracelular (MEC) y una variedad de células mesenquimales, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, pericitos y leucocitos 1-3. El estroma asociado al tumor es sensible a importantes señales paracrinas liberada por las células de carcinoma vecinos. Durante el proceso de la enfermedad, a menudo se convierte en el estroma poblada por carcinoma asociado a los fibroblastos (CAF), incluyendo un gran número de miofibroblastos. Estas células han sido previamente extraídos de diferentes tipos de carcinomas humanos para su cultivo in vitro. Una subpoblación de CAF se distingue a través de su regulación de la actina de músculo liso α-(α-SMA) la expresión de 4,5. Estas células son un sello de &quot;fibroblastos activados&quot; que comparten propiedades similares a miofibroblastos commonly observada en los tejidos dañados y fibrosis 6. La presencia de este subgrupo miofibroblástico CAF está muy relacionada con tumores malignos de alto grado y se asocia con mal pronóstico en los pacientes. Muchos laboratorios, incluido el nuestro, han demostrado que la CAF, cuando se les inyectó células de carcinoma en ratones inmunodeficientes, son capaces de promover la génesis tumoral sustancial 7-10. CAF preparado a partir de pacientes con carcinoma, sin embargo, con frecuencia sufren senescencia durante la propagación de la cultura limitar la extensión de su uso a través de la experimentación en curso. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado una nueva técnica para generar experimentalmente inmortalizado humanos líneas de células mamarias CAF (exp-CAF) a partir de fibroblastos humanos de mama, con un pecho coimplantation modelo de xenoinjerto tumoral. Con el fin de generar exp-CAF, los padres fibroblastos de mama humano, procedente de los tejidos mamoplastia de reducción, fueron los primeros immortalised con hTERT, la subunidad catalítica de la telomerasa holoenzyme, y para expresar las buenas prácticas agrarias y un gen de resistencia a la puromicina. Estas células fueron coimplanted con células MCF-7 humanas de carcinoma de mama que expresan un oncogén ras activado (MCF-7-ras células) en un xenoinjerto de ratón. Después de un período de incubación in vivo, el primer inyectado fibroblastos humanos mamarios se extrajeron de los xenoinjertos de tumores en la base de su resistencia a la puromicina 11. Hemos observado que el residente de fibroblastos humanos mamarios se han diferenciado, la adopción de un fenotipo tumoral miofibroblástico y adquirió propiedades que promueven durante el curso de la progresión del tumor. Es importante destacar que estas células, que se define como exp-CAF, imitan el fenotipo de promoción tumoral miofibroblástico de CAF aislado de los carcinomas de mama disecados de los pacientes. Nuestra xenoinjerto de tumor derivado de exp-CAF por lo tanto, proporcionar un modelo eficaz para estudiar la biología de la CAF en breas humanost carcinomas. El protocolo descrito también se puede extender para la generación y caracterización de diferentes poblaciones CAF derivados de otros tipos de carcinomas humanos.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.

Generación experimental de carcinoma asociada a los fibroblastos (CAF) a partir de fibroblastos humanos mamarios

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

23.3K vistas.  University of Manchester. Carcinoma asociados fibroblastos (CAF), rica en miofibroblastos presentes en el estroma tumoral, juegan un papel importante en la conducción de la progresión del tumor. Hemos desarrollado un modelo de tumor coimplantation xengraft para generar experimentalmente CAF a partir de fibroblastos humanos mamarios. El protocolo describe cómo establecer miofibroblastos CAF que adquirir la capacidad de promover la génesis tumoral.

Video: Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Investigación

Medicina

Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel stenting are crucial for translational approaches1,2.
The commonly used animal models include mice, rats, rabbits, and pigs3-5. However, the translation of these models into clinical settings remains difficult, since those biological processes are already studied in animal vessels but never performed before in human research models6,7. In this video we demonstrate a new humanized model to overcome this translational gap. The shown procedure is reproducible, easy, and fast to perform and is suitable to study the development of intimal hyperplasia and the applicability of diverse stents.
This video shows how to perform the stent technique in human vessels followed by transplantation into immunodeficient rats, and identifies the origin of proliferating cells as human.

Human Internal Mammary Artery IMA Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis

This video shows a model to study the development of intimal hyperplasia after stent deployment using a human vessel (IMA) in an immunodeficient rat model.

Humanos mamaria interna arteria (IMA) de Trasplantes y colocación de un stent: un modelo humano para estudiar el desarrollo de la reestenosis intra-stent

Preclinical in vivo research models to investigate pathobiological and pathophysiological processes in the development of intimal hyperplasia after vessel ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Piel biopsia en sacabocados explante cultura para Derivación de fibroblastos humanos primarios

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Carriage Experimental neumocócica Humanos

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Los fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Caracterización del tejido después de un nuevo método de desagregación para la piel micro-injertos Generación

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...