Mateo O&#39;Sullivan y Zhou Fei son los destinatarios de Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica de Postgrado Becas de Investigación Médica.

Debe prestarse especial atención a la imprimación y diseño de la sonda. Todas las secuencias disponibles de los objetivos de interés a partir de bases de datos como GenBank deben ser utilizados para identificar áreas de conservación que son objetivos adecuados. Cuando un gran número de objetivos se ampliaron en un ensayo de MPCR individuales, cada secuencia amplificada debe ser de longitud similar, y no debe exceder de 300 pares de bases para evitar la competencia. Una aplicación alternativa del método consiste en amplificar un objetivo a más largo usando cebos contra regiones conservadas y el uso de sondas múltiples para identificar la secuencia de variación dentro de la amplificación. En este caso, la amplificación de PCR puede ser mayor. Temperaturas primer recocido a todos debe ser similar, con las condiciones de PCR ajustarse en consecuencia. Cebadores que forman la estructura secundaria fuerte o dímero imprimación debe ser evitado. El Sigma Aldrich ADN calculadora ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) puede ser utilizado para predecir con fiabilidad estas características. Sondas de ADN deben ser diseñados para tener recocido temperaturas cercanas a 60 ° C. Para maximizar la especificidad, dos sondas para cada objetivo de interés pueden ser incluidos en el ensayo, se hibridan con la cadena de ADN hacia delante adyacente al sitio de unión del cebador inverso, y el otro a la cadena inversa adyacente al sitio de unión del cebador hacia delante. En este caso, tanto adelante y atrás deben ser modificados con biotina. Si sólo hay una sonda por objetivo amplificado se está utilizando, entonces sólo una imprimación tiene que ser modificado biotina. En el diseño de cebadores y sondas para el ensayo de MPCR / RLB es altamente recomendable que use métodos in silico para predecir los productos de PCR y la hibridación de la sonda que se correlaciona con los resultados in vitro. Lo ideal sería que esto se hace con los aislamientos para los cuales la secuencia del genoma completo está disponible. Software como FastPCR (disponible en http://primerdigital.com/fastpcr.html) se puede utilizar para este propósito. Señal de la sonda débil o ausente puede predecir en el análisis in silico indica desajustes de pares de bases que resulta de la temperatura de la sonda de baja de recocido. Técnicas de extracción de ADN puede variar en función de las muestras sometidas a prueba y las condiciones de PCR se depende de diseño de la cartilla. Los lectores deben consultar publicaciones sobre ensayos individuales para obtener más información acerca de la extracción de ADN y reactivos PCR y las condiciones de 1.19. Cada ensayo se ejecuta con los controles adecuados para proporcionar al menos una señal negativa de la sonda positiva y una de cada sonda en la membrana, así como un ADN sin control. Además, es conveniente incluir una sonda en la parte superior de la membrana que se espera que sea positivo para todas las muestras (por ejemplo: una especie o una sonda específica del género en el caso de un microorganismo). Esto sirve como una sonda de control positivo, sino que también permite una fácil orientación de los resultados. 1. Preparación de la membrana <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ul><li> 100 ml de NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml de NaHCO3 0,5 M </li><li> 20 ml 16% EDAC </li><li> 250 ml NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - lugar en el baño de agua a 60 ° C </li><li> 250 ml de 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pre-caliente el horno a 60 ° C. </li><li> Limpie el Miniblotter Immunetics con etanol al 70%. </li><li> Diluir las sondas de oligonucleótidos en 0,5 M NaHCO 3 a una concentración final de 2 pmol / l, y un volumen de 200 l. </li><li> Cortar una membrana de nylon BiodyneC de 15x15 cm. Con un lápiz y una regla, la regla de un espacio de 0,5 cm en la parte superior de la membrana y escribe los detalles aquí. </li><li> Membrana que sella en una bolsa de plástico con 20 ml recién hecho 16% de solución de EDAC y el rock a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Lavar la membrana en agua desionizada durante 30 segundos. </li><li> Coloque la membrana en miniblotter con canales que cruzan la membrana (paralela a la línea de lápiz). Poner amortiguador de la ayuda en su lugar y papel secante cerca. Aspirado de líquido de los canales. </li><li> Llenar las calles 1 y 45 con 150 l 0,5 M NaHCO 3. Use 150 ml de cada solución de la sonda para llenar los carriles 2-44 en secuencia, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire. Si una burbuja de aire aparece en el canal, manteniendo la pipeta en el lugar, rápidamente aspirar la solución para que la burbuja de aire para flotar en la parte superior de la pipeta y vuelva a intentarlo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Aspirar las soluciones de la sonda, retirar la membrana y lavar con 250 ml de NaOH 0,1 M a temperatura ambiente durante 9 minutos. </li><li> Lavar la membrana en 250 ml 2xSSPE durante 30 segundos. </li><li> Lavar la membrana en 250 ml previamente calentada 2xSSPE/0.1% SDS en el horno a 60 ° C durante 5 minutos. </li><li> Si no se utilizan para la hibridación de inmediato, lavar la membrana en 240 ml de EDTA 20 mM a temperatura ambiente durante 20 minutos (reservar 10 ml restantes), y sellar la membrana en una bolsa de plástico con el resto de 10 ml de EDTA 20 mM y el almacenamientoe en el refrigerador a 4 ° C. </li><li> Lavar con miniblotter Pyroneg detergente y cepillo. Enjuagar y dejar secar. </li></ol> 2. Hibridación y detección <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - almacenar en un baño de agua a 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - almacenar en un baño de agua a 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - tienda en el horno a 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - mantener a temperatura ambiente </li><li> 500 ml SDS al 1% - tienda en un baño de agua a 60 ° C inicialmente (para el paso 3) </li><li> 250 ml de 20 mM EDTA - almacenar a temperatura ambiente (para el paso 3). </li></ul></li><li> A su vez en un horno a 60 ° C y un horno a 42 ° C. Hierva el agua en un vaso grande en una placa. </li><li> Limpie Miniblotter con etanol al 70% Immunetics. </li><li> Alícuota de 10 ml de 2xSSPE/0.1% SDS en un recipiente pequeño. Añadir 20 l de cada producto de PCR de 150 l 2xSSPE/0.1% SDS en tubos numerados. </li><li> Hervir los productos de PCR durante 10 minutos a 100 ° C con los titulares de espuma de poliestireno. Coloque sobre hielo inmediatamente a por lo menos 5 minutos. </li><li> Lavar la membrana en 240 ml restantes 2xSSPE/0.1% SDS a 60 º C horno durante 5 minutos. </li><li> Coloque la membrana en miniblotter con cojín de apoyo. Orientar así los canales corren en forma vertical (perpendicular a la línea de lápiz). </li><li> Aspiración el exceso de líquido de los canales miniblotter. </li><li> Agregar el resto 150 l 2xSSPE/0.1% SDS a los canales de primera y la última. Añadir hervida productos de PCR para los canales restantes (2-44) en la secuencia, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire. </li><li> Lugar miniblotter plana en estufa a 60 º C durante 1 hora para permitir la hibridación tenga lugar. </li><li> Líquido aspirado de cada canal y luego quitar la membrana de miniblotter. </li><li> Lavar dos veces en 250 ml precalentado 2xSSPE/0.5% SDS en estufa a 60 º C durante 10 minutos. </li><li> Humedezca la malla de nylon de separación con 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C y la utilizan para enrollar la membrana. </li><li> Coloque la membrana enrollada en un tubo de rodillo, y se despliegan para garantizar la membrana se apoya en la superficie interior. Añadir 3 l de estreptavidina-peroxidasa (Roche Applied Science) a 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C y añadir al tubo del rodillo. Tornillo de tapa firmemente y se incuba en el horno de rodillos a 42 ° C durante 60 minutos. Asegúrese de que la dirección del rodillo es tal que la membrana no se cierra. Compruebe periódicamente que no haya fugas. </li><li> Lave miniblotter en Pyroneg agua y detergente, enjuague y deje secar. </li><li> Quitar la membrana de tubo del rodillo. Lavar dos veces en el resto de 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C durante 10 minutos. </li><li> Lavar dos veces en 2xSSPE a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Encienda el horno a 80 ° C y el lugar 500 ml SDS al 1% en el horno a precalentar. </li><li> Constituyen el 15 por Amersham ml solución de detección ECL (7,5 ml de la solución A y 7,5 ml de solución B). Deseche 2xSSPE y añadir solución de detección. Roca suavemente con la mano durante 2 minutos asegurar una cobertura completa de la membrana con la solución. Desechar la solución de quimioluminiscencia. </li><li> Corta dos hojas de plástico transparente para encajar cartucho de la exposición. Coloque la membrana entre las dos hojas y el lugar en el cartucho de la exposición. </li><li> Proceder a la cámara oscura. Bajo la luz roja, añadir la película de detección ECL a los cartuchos y exponer durante 5 minutos. Oreja de perro en la esquina inferior derecha de la película después de la retirada para permitir la orientación correcta cuando se visualiza. </li><li> Desarrollar la película con revelador automático o baños químicos según las instrucciones del fabricante. </li><li> Repetir la exposición con tiempos de exposición más largos o más cortos si es necesario. </li></ol> 3. La regeneración de la membrana <ol><li> Lavar la membrana en 250 ml de SDS al 1% a 80 ° C durante 30 minutos dos veces. </li><li> Lavar la membrana en 240 ml de EDTA 20 mM a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Sello de la membrana en una bolsa de plástico con 10 ml de 20 mM EDTA y refrigerar a 4 ° C para una futura reutilización. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Los resultados se ven mejor mediante la colocación de la película sobre una cuadrícula impresa, o bien escanear la imagen e importar en software como BioNumerics (Matemáticas Aplicadas, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Cada resultado de la sonda debe ser interpretado con referencia a las sondas de control positivo y negativo. Los resultados son los mejores calificados como negativos, débiles o positivo. Los resultados positivos son en donde la señal es tan fuerte como o más fuerte que la sonda de control positivo. Los resultados negativos son en donde la señal está ausente o es igual a la del control negativo (en el caso de la señal de fondo). Los resultados son débiles, donde la señal es más débil que la sonda de control positivo, pero más fuerte que el control negativo. Débiles resultados puede ser el resultado de mutaciones puntuales que conducen a la sonda de unión débil, o por falta de señales específicas de la formación de dímeros de imprimación. El uso de dos sondas por objetivo de interés puede mejorar la especificidad, donde un resultado débil única forma segura se puede interpretar como no específico de la señal. Si sigue habiendo dudas, una sola reacción de PCR compleja se puede realizar con base de gel de detección y la secuencia de cualquier amplificadorlified producto para determinar si el resultado es altamente positivo. Un resultado representativo se muestra en la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Los principios MPCR / RLB (P1) Paso 1.9. Amina sondas modificadas están obligados covalentemente a una membrana de nylon. (P2) Paso 2,10. Biotina modificado los productos de PCR se hibridan con las sondas. (P3) Paso 2,14. Estreptavidina, marcada con peroxidasa, se incubó con la membrana y se une a la biotina. (P4) Pasos 2.19-2.21. Peroxidasa cataliza la reacción de los reactivos de detección ECL, la producción de luz a la que la película sensible a la luz se expone. La membrana se lava para su reutilización. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Representante MPCR / RLB resultado. Las muestras 1 a 6 representan los controles positivos - entre ellos hay al menos una señal de la sonda positiva para cada una de las 43 sondas. Cada secuencia de destino (A través de U) se detecta con dos sondas diferentes para maximizar la especificidad. Sondas de A1 y A2 representan especies sondas específicas que se espera que sea positivo para cada muestra y ayudar con la orientación de la película. Sonda A1 se repite en la parte inferior de la membrana. Muestras 7 y 8 son los controles negativos. Tenga en cuenta que las sondas Q1, Q2, T1 y T2 tienen la señal en los controles negativos, indicando una unión no específica probable de cebos o producto de imprimación dímero. Re-diseño de estas sondas o cebadores se requeriría. Sondas C1, D1 y mostrar F1 cruzando la membrana probablemente debido a la absorción de algunos no específica del conjugado estreptavidina-peroxidasa o sustrato quimioluminiscente, sin embargo, esto es fácil de distinguir de los verdaderos señales de la sonda positiva. D1 y D2 tienen sondas de señal relativamente débil en comparación con otras sondas, esto puede ser debido a las grandes amplicones que conduce a la amplificación menos eficiente. Sonda J2 es negativo es varias muestras (1, 3, 4, 6, 39), donde la sonda J1 es positivo. Esto probablemente representa una mutación en el sitio de unión J2 para estas muestras.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método MPCR / RLB permite la detección simultánea de un gran número de amplicones de PCR. Debido a la alta sensibilidad de la sonda quimioluminiscente la detección basada en una sola reacción de PCR multiplex con un gran número de pares de iniciadores se pueden utilizar para ampliar la plantilla de ADN. Si no hay señales de la sonda se obtienen con una o más muestras, la realización de la electroforesis en gel con cualquier resto de producto de PCR puede ayudar a distinguir si el problema es con la amplificación por PCR o hibridación de la sonda. Donde todas las señales de la sonda en la membrana son débiles o inexistentes, pero la electroforesis en gel indica el éxito de amplificación de PCR, las posibilidades incluyen problemas con el etiquetado de la membrana, la regeneración incorrecta de la membrana después de su uso anterior, las temperaturas incorrectas durante la incubación, la hibridación o estreptavidina, o defectuoso estreptavidina peroxidasa o reactivo de detección. Si las muestras de control indican que las sondas individuo puede estar produciendo falsas señales negativas, solo con gel de PCR basada en la detección y posterior secuenciación se puede realizar para verificar la amplificación del producto de PCR y en busca de variación de la secuencia en el sitio de la sonda vinculante. Señal de la sonda débil o ausente puede ser debido al gran tamaño de amplificación: si es posible todos los amplicones debe ser de similar longitud y menos de 300 pb. Estructuras secundarias del ADN de los amplicones también se puede producir vinculante sonda pobres, y puede ser necesario re-diseño de los cebadores. Cartilla individual o concentraciones de la sonda también se puede variar para optimizar la potencia de la señal. Señales de falsos positivos debido a la sonda de la unión de los primers no amplificados o un producto de imprimación dímero puede ser investigado por realizar un solo PCR con gel basado en la detección y posterior secuenciación. Si esto ocurre, el rediseño de las sondas pueden ser necesarios. Las mutaciones puntuales en los sitios de unión de la sonda puede dar lugar a señales débiles o ausentes. Permitiendo dos sondas para cada producto amplificado lo hace fácil de detectar. Esta característica puede ser explotada con imprimación y cuidado diseño de la sonda para detectar pequeñas variaciones en la secuencia de ADN diana. En resumen, si bien hay muchos métodos de detección de los productos siguientes multiplex PCR reacciones disponibles, MPCR / RLB tiene la ventaja de ser de alto rendimiento y de bajo costo con una baja configuración de los costos. La flexibilidad del método permite su uso en una amplia gama de aplicaciones.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 5 &#39;amina C6 sondas de oligonucleótidos modificados </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> Solución 0,5 M formado a pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M solución </td></tr><tr><td> 20xSSPE buffer </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato sódico (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> El 10% de solución madre, no autoclave, se debe mantener para un máximo de 1 semana antes de su uso </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Constituyen una solución 0,5 M ajustada a pH 8,0 y autoclave </td></tr><tr><td> N-(3-dimetilaminopropil)-N &#39;-etilcarbodiimida (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Constituyen una solución de 20 ml de 16% justo antes del uso con 3,2 g EDAC y 18 ml de agua Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 m de membrana de nylon de 20x20 cm </td><td> PALL ciencias de la vida </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Desionizada, agua purificada </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Detergente líquido Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-peroxidasa </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detección reactivos </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detección reactivos </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP película de Transparencia </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Hyperfilm alto rendimiento película quimioluminiscente 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Hielo </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Consumibles utilizados en el ensayo de MPCR / RLB. <table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Hornos Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack (2) botella de rodadura y malla de nylon que separa </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Método se puede realizar con un solo horno, siempre y cuando no hay instalaciones para el mantenimiento de las soluciones a 42 ° C y 60 ° C antes de su uso </td></tr><tr><td> La danza del vientre oscilante plataforma </td><td> Stovall ciencias de la vida </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Baño de agua </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Succión </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plato caliente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La exposición del cartucho </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Película de rayos X de desarrolladores </td><td></td><td></td><td> También puede utilizar revelador, fijador y el agua en bandejas en una habitación oscura en vez de automáticodesarrollador. Lumino-cámara también puede usarse en lugar de rayos X de cine </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Equipamiento necesario para el ensayo de MPCR / RLB.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / ensayo de línea inversa Blot hibridación permite la detección de hasta 43 blancos moleculares en 43 muestras con un multiplex PCR seguida de hibridación de la sonda en una membrana de nylon, que es re-utilizable. Las sondas son 5 &#39;amina modificado para permitir la fijación de la membrana. Los iniciadores son 5 &#39;con biotina modificado que permite la detección de hibridación productos PCR utilizando estreptavidina-peroxidasa y un sustrato quimioluminiscente a través de la película fotosensible. Con una configuración de baja y los costos de consumo, esta técnica es de bajo costo (alrededor de 2 dólares EE.UU. por ejemplo), de alto rendimiento (las membranas múltiples pueden ser procesadas al mismo tiempo) y tiene un tiempo de respuesta corto (aproximadamente 10 horas). La técnica puede ser utilizada en un número de maneras. Múltiples sondas pueden ser diseñados para detectar variaciones de secuencia dentro de un solo producto amplificado, o varios productos se pueden amplificar de forma simultánea, con una (o más) sondas utilizadas para la detección posterior. Una combinación de ambos enfoques también se puede utilizar dentro de un único ensayo. La posibilidad de incluir múltiples sondas para una secuencia de un solo objetivo hace que el ensayo muy específico. Las aplicaciones publicadas de MPCR / RLB incluyen la detección de resistencia a los antibióticos 1,2 genes, la tipificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina 3-5 y Salmonella sp 6, serotipificación molecular del Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 y 10,11 enterovirus, la identificación de Mycobacterium sp 12, la detección de las verrugas genitales y del tracto respiratorio 13-15 16 y otros 17 agentes patógenos y la detección e identificación de mollicutes 18. Sin embargo, la versatilidad de la técnica significa que las aplicaciones son prácticamente ilimitadas, y no se limita al análisis molecular de los microorganismos. Los cinco pasos de MPCR / RLB son un manual) y el diseño de la sonda, b) la extracción de ADN y la amplificación por PCR c) Preparación de la membrana, d) La hibridación y detección, y e) La regeneración de la membrana.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.4K vistas.  University of Sydney. Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

La toxicidad celular de Nanogenomedicine en la línea celular MCF-7: ensayo de MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Investigación

Biología

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

PCR rápido ciclo térmico con convección térmica microescala

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays de ADN: Control de calidad de la muestra, la hibridación de la matriz y de escaneo

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...