Agradecemos a Alberto Severini y Goleski Vanessa para ayudar con el desarrollo de ensayos y comentarios críticos sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Agencia de Salud Pública de Canadá y el Programa de Asistencia a la Investigación Industrial (National Research Council de Canadá). El apoyo adicional fue obtenida de la Universidad de Saskatchewan Fondo de Publicación.

Este método fue utilizado en la investigación publicada en Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Un diagrama esquemático que representa el procedimiento general se presenta en la Figura 1. 1. Bolas de acoplamiento Esto describe los métodos que se utilizan para el acoplamiento de sondas de oligonucleótidos de poliestireno cuentas Luminex (ver Tabla 2). Los volúmenes se adaptó ligeramente para la evaluación de nuevas sondas de captura a modo de prueba, estos volúmenes se indican entre paréntesis. <ol><li> Retire 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl (EDC) en polvo de -20 ° C y caliente desecador a temperatura ambiente. </li><li> Volver a suspender las microesferas por sonciation en un baño de ultrasonidos baño de agua durante 20 segundos, luego agitación unos 20 segundos. </li><li> Transferencia de 400 l (100 l) de microesferas a un tubo Eppendorf (esto corresponde a 5x10 6 o 1,25 x10 6 microesferas). Luminex recomienda el uso de tubos de microcentrífuga de baja proteína vinculante (por ejemplo, tubos Eppendorf LoBind proteína, número de catálogo 0030 108.094) para evitar que las cuentas desacoplado se pegue a los tubos y de interferir con la recuperación de cuentas. No hemos encontrado se trata de un problema con estándar tubos de microcentrífuga de polipropileno, que suelen utilizar (por ejemplo, número de catálogo VWR 87003-298). </li><li> Pellet a 14000 xg durante 1 minuto. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Resuspender las microesferas en 50 l (12,5 l) de 0,1 a temperatura ambiente M 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) de pH 4,5. </li><li> Prepare una solución fresca de la EDC en 10 mg / ml en el agua. <ol><li> Preparar a menos de 1 ml de esta solución por un peso de 5-10 mg de EDC en una escala de análisis, a continuación, añadir agua hasta 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Añadir 1 nmol de 5&#39;-amino de oligonucleótidos de captura de C12 modificado (Tabla 2) de microesferas y mezclar mediante agitación. 1 nmol es de 5 l de 200 M oligonucleótidos. </li><li> Añadir 2,5 l de solución fresca EDC a las micro y mezclar mediante agitación durante 5 segundos. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. </li><li> Deseche la solución EDC (paso 1.6) y preparar una nueva muestra de 10 mg / ml EDC en el agua que el anterior (paso 1.6). </li><li> Añadir otro l 2.5 de nuevo solución de la EDC a las microesferas y agitar durante 5 segundos. </li><li> Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. </li><li> Lave las cuentas mediante la adición de 1 ml de 0,02% de Tween 20. Vortex (opcional ultrasonidos durante 20 segundos también) para volver a suspender las cuentas. </li><li> Centrífuga 14.000 xg 1 minuto. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Lave las cuentas de nuevo por la adición de 1 ml de sulfato de sodio 0,1% dodecilsulfato (SDS). Vortex (opcional ultrasonidos durante 20 segundos también) para volver a suspender las cuentas. </li><li> Centrífuga 14.000 xg 1 minuto. Retire y deseche el sobrenadante. </li><li> Volver a suspender las cuentas de 100 l (25 l) de Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0]. </li><li> Enumerar las cuentas en un hemocitómetro o contador Coulter para determinar la concentración de valores. </li><li> Prepare una mezcla maestra de microesferas mediante la dilución de cada cuenta a una concentración final de 100 bolas / l en buffer TE. Piscina junto cuentas correspondientes a los complejos deseados de la prueba (por ejemplo, para un ensayo de 10 complejos, mezcla de 10 cuentas diferentes, junto a una concentración final de 100/μl de cada cuenta). </li><li> Guarde el Master Mix microesferas a 4 ° C en la oscuridad. La mezcla puede ser almacenado durante meses si se mantiene en estas condiciones. </li></ol> 2. Chaperonina 60 universal, objetivo (cpn60 UT) la producción de amplificación y la generación de cadenas simples. <ol><li> Generar cadena de la polimerasa (PCR) de productos para cada muestra. Incluir el fosforotioato y establecer biotina modificado cebador 5 &#39;(Tabla 1). Ver Tabla 3 para el volumen de la mezcla y la concentración. </li><li> Inmediatamente después de la PCR se ha completado, añadir 2 l (20 unidades) de T7 exonuclease a cada tubo de PCR (el buffer de PCR será suficiente para la reacción T7). Incubar la reacción a temperatura ambiente (~ 22-25 ° C) durante 40 minutos. </li><li> Al final de esta incubación, añadir 12,5 l de 0,5 M de etileno diamino tetraacético (EDTA), pH 8,0 y mezclar. Esto da un total de ~ 64.5μl de una sola cadena de productos PCR. </li></ol> 3. La hibridación de una sola cadena de productos PCR de bolas de poliestireno junto oligonucleótidos. <ol><li> Precalentar el instrumento a 60 ° C para mantener la temperatura de hibridación durante los análisis. Encienda el calentador de la plataforma utilizando el software del instrumento y asegúrese de usar el calentador de bronce que se ajuste a la placa de PCR de estilo que contiene la mezcla de grano híbrido. </li><li> Volver a suspender las microesferas Mix Master (paso 1,20) con una pipeta, dispense una cantidad adecuada en un tubo Eppendorf, tapar el tubo, y ultrasonidos en un baño de agua sonicador durante 2 minutos. Por otra parte, para garantizar la coherencia absoluta en grano resuspension, la mezcla maestra de microesferas pueden ser resuspendidas por agitación e pipeteo, entonces sonicación de arriba, luego dispensar la cantidad deseada en un tubo de polipropileno Eppendorf. </li><li> Prescindir de 17 l de una sola cadena de productos PCR (paso 2.2) en los pocillos correspondientes de un bajo perfil-96-así Vaina placa PCR (Tabla 2). Añadir 33 l de mezcla resuspendido, cuenta sonciated a cada pocillo. Cubra con una cubierta de silicona (Tabla 2) y golpear suavemente. </li><li> Colocar la placa en el termociclador con un programa de: 95 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 10 min, 60 ° C espera, 60 ° C durante 5 minutos, al final. Iniciar el programa. </li><li> Hacer nuevas estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) la solución, usted tendrá 25 l por pocillo (hacer varios pozos adicionales). Haga SA-PE mediante la dilución de la solución de archivo SA-PE (1 mg / ml) de 1:50 a 20 mg / ml con cloruro de tetrametilamonio 1x (TMAC) buffer (TMAC 3 M, 0,1% Sarkosyl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Cuando el termociclador llega a los 60 ° C mantener el paso,abrir la tapa, quitar la silicona y añadir SA-PE directamente la solución a cada pocillo (no tomar la placa del termociclador). Vuelva a colocar la cubierta de silicona, cierre la tapa del termociclador y reanudar el programa. </li><li> Cuando el programa está completo, tome el plato y rápidamente la transferencia a la máquina BioPlex de leer. La placa debe ser leído en 10 minutos. Leer a los 60 ° C; asegurarse de que el BioPlex ha sido precalentada a esta temperatura. Asegúrese de que la altura de la sonda se ha ajustado para dar cabida a la placa utilizada, tal como se describe en el manual del usuario del instrumento utilizado. </li><li> De precisión de cuentas y detección de la señal, la configuración de la puerta de la BioPlex se debe establecer en función del tipo de microesferas que se utiliza. Perlas de poliestireno BioRad requieren una configuración de puerta de 4,335-10,000 mientras microesferas magnéticas requieren un ajuste de 5,000-25,000. También existe la opción de ejecutar la placa con el ajuste de alta PMT que aumenta el valor de ganancia reportero. Esto lo puedoUMENTAR la intensidad de las señales de menor sin embargo, es importante incluir un control negativo apropiado como señal de fondo también se incrementará. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Uno de nuestros objetivos en el desarrollo y la aplicación de este ensayo fue que sea lo más sencilla y ágil posible. Por lo tanto, optimizar la crítica post-amplificación de los pasos, incluyendo el tiempo de tratamiento T7 exonucleasa y el tiempo de hibridación con el fin de desarrollar un análisis que se puede completar en un plazo razonable. Como se muestra en la Figura 2, el tratamiento T7 de la amplificación es esencial para la generación de señales, como la mayoría de las sondas había poca señal o no con el tratamiento T7 corto o no. La señal de un aumento lineal hasta aproximadamente 40 minutos, momento en que el aumento de la señal de frenado. No hay degradación de la señal se observó incluso a las 2 horas de tiempo de tratamiento T7, lo que indica que la modificación fosforotioato de los cebadores es muy eficaz en la prevención de targedegradación t cadena como se describe 15. Hemos elegido 40 minutos para el tiempo de tratamiento T7 para minimizar el tiempo del protocolo general, sino que se desprende de la Figura 2A que el tratamiento T7 puede continuar durante mucho más tiempo. También se determinó el efecto del tiempo de hibridación en la generación de señales (Figura 2B) y encontró que 10 minutos era suficiente para la máxima señal, ya que ningún nuevo aumento de la señal se observó incluso después de 4 horas de la hibridación. Por lo tanto, una etapa de hibridación 10 minutos fue elegido de nuevo para reducir al mínimo el tiempo de ensayo general. Con estos resultados en mente, y con técnicas rápidas de extracción de ADN, como InstaGene (Bio-Rad), el ensayo general que incluye la extracción de ADN, PCR y análisis de Luminex se puede realizar en 4-5 horas. En una nota de precaución, el nivel de agregación de las cuentas de poliestireno durante una ejecución de Luminex o BioPlex puede tener un gran impacto en la eficiencia de la prueba. El software BioPlex mostrará el nivel de agregación de cuentas, que ocurre cuandomás de un cordón se detecta en la ruta de láser y los resultados en la exclusión de la señal de hibridación de los agregados. Agregación de cuentas aparente también puede ser causada por cualquier partícula que no es el tamaño adecuado para una sola cuenta, e incluso puede ser causada por las burbujas de aire. En cualquiera de estos eventos, la señal de los agregados de cuentas, burbuja de aire o de partículas se descarta. En la mayoría de los casos, nos encontramos con que la agregación de cuentas es mínima (Figura 3) y el nivel previsto de 100 eventos de conteo para cada cuenta es fácil de alcanzar. Ocasionalmente, sin embargo, las cuentas muestran un incremento moderado (Figura 3B) o grave (Figura 3 C) nivel de agregación. En estos casos, ya que la mayoría de los datos se descartan, el instrumento puede tener problemas para llegar a 100 eventos por tipo de cuentas y los resultados pueden ser cuestionables. El paso de ultrasonidos (paso 3.2) tiene la intención de minimizar la agregación de cuentas. Además, el almacenamiento de las cuentas como una mezcla de microesferas maestro diluida (paso 1,20) puede ayudar. Hemos notado que TMAC excluir de la hybribuffer dization - añadiendo que el diluyente SA-PE en su lugar (paso 3.5) - ayuda a reducir la agregación de cuentas. Por otra parte, aunque no he probado esto, las cuentas más recientes magnética disponible en Luminex o BioRad se cree que mostrar una menor tendencia a agregarse. Los resultados de la aplicación de un conjunto complejo de 5 Luminex objetivo G. vaginalis, A. Vaginas, L. Iners, L. Crispatus, y L. gasseri junto con los correspondientes Gram frotis vaginal hisopo se muestran en la Figura 4. Estas muestras fueron tomadas de un solo individuo en múltiples momentos. En el momento 0, la persona fue diagnosticada con la VB basado en la tinción de Gram (Figura 4) y los resultados de Luminex de esta misma muestra (Figura 4) muestran que de los organismos representados en la matriz, G. vaginalis fue más frecuente, mientras que A. Vaginas y L. Iners también fueron positivos. Nueve días después, el individuo todavía estaba BV positivo y el signal de G. vaginalis había aumentado considerablemente, mientras que A. Vaginas y L. Iners todavía positivo. Es importante destacar que, después de este tiempo el individuo comenzó a hacer la transición a una microbiota normal como bacilos Gram positivos se detecta en las manchas (Figura 4), ​​mientras que la señal de G. vaginalis disminuyó y la señal de L. Iners aumentado (Figura 4B). Por nuestra definición original de BV con este método (muestras positivas de G. vaginalis y / o A. Vaginas fueron considerados positivos BV) 13, este individuo fue positivo BV en todos los tiempos, aunque la tinción de Gram no pudo detectar G. vaginalis en los puntos de tiempo de estos dos últimos. Con el método de Luminex se describe aquí, las tendencias pueden ser fácilmente comparado con los métodos basados ​​en la secuenciación, y los resultados de la prueba de Luminex general corroborar la tinción de Gram 13, mientras que proporcionar información adicional sobre la identidad de organismo y de la abundancia. <img src=&quot;/ Files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Esquema del protocolo de Luminex para determinar el perfil de la microbiota de una muestra compleja clínicas o ambientales. El protocolo comienza con el ADN de plantilla que se ha extraído de la muestra de interés. (1) Generar productos PCR de ADN de la plantilla con el capítulo específico de biotina, fosforotioato modificados cpn60 UT PCR, junto con modificar cpn60 UT PCR (Tabla 1), (2) Esto genera un conjunto de productos de PCR en representación de la microbiota con la biotina fosforotioato modificación de una cadena, (3) Resumen del producto de doble cadena PCR con exonucleasa T7, que no pueden degradar la cadena fosforotioato modificado y por lo tanto genera una sola cadena de ADN que se ha modificado en el extremo 5 &#39;con biotina, (4) Pareja bolitas de poliestireno para cada especie cpn60 sondas UT - cada cuenta tiene una única dirección espectral (indicado por el color de cuentas) que idiscernible por el Luminex o instrumento Bio-Plex s; (5) híbridos con el producto una sola cadena PCR generados a partir de la muestra de interés para el conjunto de especies específicas, junto oligonucleótidos cuentas; (6) Añadir estreptavidina-ficoeritrina conjugado que se une a la biotina sola cadena de productos PCR, y actúa como un indicador de la hibridación; (7) Determinar la dirección espectral (bolas de identidad) y la intensidad de la señal de hibridación mediante un instrumento Luminex o Bio-Plex. Por lo menos 100 cuentas se cuenta para cada identidad de cuentas y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la señal de ficoeritrina se presenta como la salida. Hasta 100 tipos diferentes de cuentas se puede evaluar de forma simultánea, sino un ensayo que muestra la discriminación de los tres tipos de cuentas es ilustrado. (8) Cuando el MFI de PCR se replica generados a partir de la misma muestra es significativamente mayor que el control negativo para un determinado grano (una cola de la t-test, p &lt;0,05), la muestra se considera positiva para ese organismo.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Optimización de los parámetros del ensayo Luminex. Cinco diferentes sondas dirigidas a anaerobius Peptostreptococcus se utilizaron con amplicones generados a partir de una plantilla mixta que comprende plásmidos que contienen el clonado cpn60 UT de 20 bacterias se sabe están asociados con la vagina, incluyendo P. anaerobius. (A). Efecto del tiempo de tratamiento T7 exonucleasa. El protocolo descrito anteriormente fue seguido, pero el tiempo de tratamiento con exonucleasa T7 fue variada antes de la hibridación y la intensidad media de fluorescencia (MFI) se determinó para todas las sondas. (B). Efecto del tiempo de hibridación. El protocolo descrito anteriormente fue seguido con una variedad de tiempos de hibridación. Los mismos conjuntos de sondas se utilizan con una amplificación generados a partir de la misma plantilla que en la A y la intensidad media de fluorescencia (MFI) se determinó para todas las sondas. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinación de la agregación de cuentas el uso de software BioPlex. Tres ejemplos de carreras BioPlex en el que el nivel de agregación de cuentas es (A) aceptable (5%), (B) en el límite (50%); e inaceptable (C) (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Aplicación de un conjunto complejo de 5 Luminex para el diagnóstico BV en muestras secuenciales tomadas de la misma persona. (A). Tinción de Gram diapositivas que muestran los tradicionales de diagnóstico utilizado para evaluar cada muestra para la vaginosis bacteriana. (B). Aplicación de una serie de 5 complejos Luminex preparado y ejecutado tal como se describe en este protocolo para las mismas cuatro muestras se muestra en (A). Objetivos bacteriana cuya IMF señal fue significativamente positivo según nuestra definición (de una cola de la t-test, p &lt;0,05) se señalan con un asterisco (*).

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No hay conflictos de interés declarado.

La especificidad de la generación de la señal es de suma importancia, usted debe estar seguro de que la señal observada refleja realmente la detección de amplificación generados a partir de ese organismo. Software como PrimerPlex (Premier Biosoft) pueden ayudar a diseñar las sondas que se hibridan de manera eficiente, pero puede o no hibridizan a las especies no objetivo. Cuando universal de PCR se utilizan como se describe en este protocolo, es importante tener en cuenta que la amplificación generada representa ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de oligonucleótidos </td><td> Empresa </td><td> Secuencia de un </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, u otros </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, fosforotioato-C, E, G-fosforotioato; F, fosforotioato-A, I, inosina, Y, C y T, R, A o G, K, T, G, S, C o G. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Secuencias de los oligonucleótidos modificados para Universal cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo</td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimida HCl (EDC) </td><td> Atravesar </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Bolas fluorescentes de poliestireno: Microplex microesferas (Luminex), o Bio-Plex COOH bolas (Bio-Rad) </td><td> Luminex o Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx donde xxx corresponde a la identificación de cuentas </td><td> Partículas magnéticas se están haciendo disponibles para el acoplamiento de oligonucleótidos y pueden ofrecer ciertas ventajas. No han sido juzgados por estos autores. </td></tr><tr><td> Oligonucleótidos de captura (5 &#39;amino modificado C12) </td><td> Invitrogen, IDT, u otros </td><td> diferentes </td><td> Nivel de pureza desalada es aceptable. Secuencias de las sondas de captura utilizado para caracterizar muestras vaginales se proporcionan en el manuscrito en el que se basa este protocolo 13. </td></tr><tr><td> T7exonucleasa </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Tenga cuidado para obtener alta pureza SA-PE, este número de catálogo se recomienda </td></tr><tr><td> Vaina 96 y placas de PCR </td><td> Pescador </td><td> CS006509 </td><td> encajaban en ambas termociclador de 96 pozos y la máquina BioPlex </td></tr><tr><td> Vaina de sellado alfombra </td><td> Pescador </td><td> CS006555 </td><td> Puede ser reutilizado, lavar con agua jabonosa, enjuague bien y seque </td></tr><tr><td> TMAC 5M </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex o instrumento Luminex </td><td> Bio-Rad o Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex software de diseño de la sonda </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Sugerido para la sonda de Luminexsigno, aunque otras plataformas de software se puede utilizar </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> componente </td><td> l / ensayo </td><td> ensayos μl/100 </td><td> concentración final </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM de cada uno </td></tr><tr><td> H279BP, 25 M </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 M </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 M </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 M </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> De agua </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totales </td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Sugerido mezclas de PCR con primers modificados cpn60 UT (Tabla 1). El ensayo está programado para 5 l de ADN y 0,5 l (2.5U) de Taq ADN polimerasa (Invitrogen). Normalmente se preparan grandes volúmenes (por ejemplo, suficiente para 100 ensayos) y almacenados a -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

La vaginosis bacteriana (VB) es un síndrome recurrente polimicrobiana que se caracteriza por un cambio en la &quot;normal&quot; microbiota de Lactobacillus dominado por una microbiota dominado por una serie de especies bacterianas, incluyendo Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginas, y 3.1 los demás. Esta condición se asocia con una serie de resultados negativos para la salud, incluyendo la adquisición del VIH 4, y puede ser difícil de manejar clínicamente 5. Además, el diagnóstico de vaginosis bacteriana se ha basado en el uso de la tinción de Gram de los frotis de hisopado vaginal que se califican en diversos criterios numéricos 6,7. Si bien este diagnóstico es sencillo, barato y bien adaptado a entornos con recursos limitados, que pueden sufrir de problemas relacionados con las interpretaciones subjetivas y no le da un perfil detallado de la composición de la microbiota vaginal 8. Los recientes esfuerzos de secuenciación profunda han revelado una microbiota rico, diverso, con la vaginaclaras diferencias entre las muestras tomadas de las personas que son diagnosticadas con BV en comparación con los individuos que se consideran normales 9,10, lo que ha dado como resultado la identificación de una serie de posibles objetivos para el diagnóstico molecular de la BV 11,12. Estos estudios han proporcionado una gran cantidad de información útil, pero la secuencia no es profundo y práctico como un método de diagnóstico en un entorno clínico. Recientemente hemos descrito un método para rápidamente el perfil de la microbiota vaginal en un formato multiplex utilizando oligonucleótidos, junto con la detección de perlas fluorescentes en una plataforma Luminex 13. Este método, como el actual la tinción de Gram basada en métodos, es rápido y sencillo, pero añade la ventaja adicional de la explotación del conocimiento molecular derivados de estudios de secuenciación en el diseño de la sonda. Por lo tanto, este método proporciona una forma de perfil de los microorganismos más importantes que están presentes en una muestra vaginal que se puede utilizar para diagnosticar BV con una alta especificidad y sensibilidad de un borradorared con tinción de Gram, mientras que el suministro de información adicional sobre la presencia y abundancia de especies de una manera semi-cuantitativa y rápida. Este método múltiple se puede ampliar mucho más allá del alcance de los actuales ensayos de PCR cuantitativa a organismos particulares, que actualmente se limita a 5 ó 6 pruebas diferentes en una sola muestra 14. Es importante destacar que el método no se limita a la detección de bacterias en muestras vaginales y pueden ser fácilmente adaptados al perfil rápidamente casi cualquier comunidad microbiana de interés. Por ejemplo, recientemente hemos comenzado a aplicar esta metodología para el desarrollo de herramientas de diagnóstico para su uso en plantas de tratamiento de aguas residuales.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K vistas.  Agriculture and Agri-Food Canada. Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

El uso de fluorescentes inmunoquímica para la detección de Edwardsiella ictaluri En el bagre de canal ( I. punctatus) Muestras

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

La determinación de la actividad fagocítica de los anticuerpos de muestras clínicas

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.