Matthew O&#39;Sullivan ve Fei Zhou Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Lisansüstü Tıbbi Araştırma Bursu alıcıları.

Dikkatli göz astar ve prob tasarımı verilmelidir. GenBank olarak veritabanlarından ilgi hedefleri mevcut tüm dizileri uygun hedefler korunmuş alanları tanımlamak için kullanılmalıdır. Hedeflerin çok sayıda tek bir mPCR tayininde amplifiye olduğu yerlerde, her güçlendirilmiş dizisi benzer uzunlukta olmalı ve rekabeti önlemek için 300 baz çiftinden geçmemelidir. Yönteminin bir alternatif uygulama korunmuş bölgelere karşı primerler kullanılarak bir uzun hedef yükseltmek ve Amplikon içinde dizisi varyasyonu tanımlamak için birden fazla probları kullanmak. Bu durumda, güçlendirilmiş PCR ürününün daha uzun olabilir. Primer tavlama sıcaklıkları buna göre ayarlanır PCR koşulları ile benzer olmalıdır. Güçlü bir ikincil yapı veya astar dimer formu Astarlar kaçınılmalıdır. Sigma Aldrich DNA hesap makinesi ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) bu özellikleri güvenilir bir şekilde tahmin etmek için kullanılabilir. DNA probları ile 60 ° C Tavlama sahip olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır Özgüllüğü maksimize etmek için, tahlil, biri ters astar bağlayıcı sitesine bitişik ileri DNA iplikçik literatürde ve diğer ileri astar bağlayıcı sitesine bitişik ters iplikçik ilgi her hedef için iki probları dahil edilebilir. Bu durumda, her iki ileri ve geri primerler biotin değiştirilmesi gerekir. Amplifiye hedef başına sadece tek bir prob kullanılan ediliyorsa, o zaman sadece bir astar biotin değiştirilmiş olmak zorunda. Astar ve mPCR / RLB testi için yoklamaları tasarlarken güçlü bir in vitro sonuçlar ile korele PCR ürünleri ve prob hibridizasyon tahmin siliko yöntemleri kullanmanız önerilir . İdeal olarak bu tüm genom dizisi kullanılabilir olduğu izolat kullanılarak yapılır. FastPCR (http://primerdigital.com/fastpcr.html mevcut) gibi yazılımlar, bu amaç için kullanılabilir. Zayıf ya da hiç prob sinyali siliko analizinde, düşük prob tavlama sıcaklıklarda baz çifti uyumsuzluklarını gösterir tahmin edilebilir . DNA ekstraksiyon teknikleri test edilen numunelerin bağlı olarak değişecektir ve PCR koşulları astar tasarım bağımlı olacaktır. Okuyucular, DNA ekstraksiyonu ve PCR ve koşulları 1-19 ile ilgili daha fazla bilgi için bireysel testlerin yayınlara adlandırılır . Her test membran üzerindeki her bir prob için en az bir pozitif ve bir negatif prob sinyali yanı sıra DNA kontrolü sağlamak için uygun kontrolleri ile çalıştırılır. Ayrıca, tüm örnekler (bir mikro-organizma halinde bir tür ya da cins özel prob gibi) pozitif olması bekleniyor membran üst kısmında bir prob için faydalıdır. Bu bir pozitif kontrol probu olarak görür, ama aynı zamanda sonuçların kolay yönlendirme izin verir. 1. Membran Hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8.4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml% 16 EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml% 2xSSPE/0.1 SDS - 60 ° C&#39;de su banyosunda </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> 60 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma fırın </li><li> Immunetics Miniblotter% 70 etanol ile temizleyin. </li><li> 2 pmol / ml son bir konsantrasyon ve 200 ul hacmi 0.5 M NaHCO 3 oligonükleotid problar sulandırınız. </li><li> 15x15 cm BiodyneC naylon membran kesin. 0.5 cm&#39;lik bir kalem ve cetvel kullanarak, membran üst kısmı boyunca kapalı kural ve burada ayrıntıları yazmak. </li><li> 20 ml plastik bir torba içinde Seal membran, 10 dakika boyunca taze oda sıcaklığında% 16 EDAC çözüm ve kaya yaptı. </li><li> 30 saniye boyunca, deiyonize su ile membran yıkayın. </li><li> Membran (kalem hattına paralel) üzerinde çalışan kanallar miniblotter yerleştirin membran. Yeri ve yakın emici kağıdı destek yastık koyun. Kanallarından sıvı aspire. </li><li> 150 ul 0.5 M NaHCO 3 ile 1 ve 45 şeritli doldurun. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olmak, şerit sırayla 2-44 doldurmak için her sonda çözüm 150 ul kullanın. Bir hava kabarcığı pipet yerde tutarak, kanal görünmüyor hızla hava kabarcığı pipet üst şamandıra izin çözüm aspirat, daha sonra tekrar deneyin. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Prob çözümler aspire, membran çıkartın ve oda sıcaklığında 250 ml 0,1 M NaOH 9 dakika süreyle yıkayın. </li><li> 30 saniye boyunca 250 ml 2xSSPE membran yıkayın. </li><li> ° C 5 dakika boyunca 60 250 ml önceden ısıtılmış fırında 2xSSPE/0.1% SDS membran yıkayın. </li><li> Hemen hibridizasyon için kullanılan değilse, oda sıcaklığında 20 dakika (saklı kalan 10 ml) 240 ml 20 mM EDTA membran yıkama, daha sonra kalan 10 ml 20 mM EDTA ve stor ile plastik torba membran mühüre buzdolabında 4 ° C </li><li> Miniblotter deterjan ve fırça Pyroneg ile yıkayın. Durulayın ve kurumasını bekleyin. </li></ol> 2. Hibridizasyon ve algılama <ol><li> Aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - su banyosu mağaza, 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - su banyosu mağaza, 60 ° C </li><li> 500 ml% 2xSSPE/0.5 SDS - 42 fırın mağaza ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - oda sıcaklığında tutmak </li><li> 500 ml% 1&#39;lik SDS - 60 su banyosunda mağaza ° C başlangıçta (adım 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA oda sıcaklığında saklayın (3 adım için). </li></ul></li><li> 60 yaşında bir fırın açın ° C ve bir fırın 42 ° C. Bir ocak üzerinde büyük bir beher kaynatmak için su getir. </li><li> % 70 etanol ile Miniblotter Temiz Immunetics. </li><li> Küçük bir kap içine 2xSSPE/0.1% SDS kısım 10 ml. Her PCR ürünü 20 ul 150 numaralı tüpler% ul 2xSSPE/0.1 SDS ekleyin. </li><li> PCR ürünleri kaynatın 10 dakika için 100 ° C strafor sahipleri. En az 5 dakika boyunca buz üzerinde hemen yerleştirin. </li><li> 60 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS kalan membran ° C fırında 5 dakika yıkayınız. </li><li> Miniblotter desteğiyle yastık ile yerleştirin membran. Yolunuzu kadar kanal (kalem hattı dik) dikey olarak çalıştırın. </li><li> Miniblotter kanallarından Emiş aşırı sıvı. </li><li> Ilk ve son kanallar kalan 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS ekleyin. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olmak, sırayla kalan kanal (2-44) haşlanmış PCR ürünleri ekleyin. </li><li> 60 düz Yeri miniblotter hibridizasyon yer almasına izin ° C fırında 1 saat. </li><li> Her kanal aspire sıvı sonra miniblotter membran kaldırmak. </li><li> 10 dakika boyunca 60 ° C fırında prewarmed 250 ml% 2xSSPE/0.5 SDS iki kez yıkayın. </li><li> 2xSSPE/0.5% 42 SDS ile naylon ayıran örgü ıslatın ° C ve membran rulo kullanın. </li><li> Silindir tüp içine yerleştirin membran haddelenmiş, ve membran iç yüzey abuts sağlamak için alemini. 42 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS 3 ul streptavidin-peroksidaz konjuge (Roche Uygulamalı Bilimler) ° C ve silindir tüpü eklemek. Kapağı sıkıca vidalayın ve rulo fırında 42 ° C&#39;de 60 dakika için. Rulo yönde membran sıkın olmadığı gibi olduğundan emin olun. Sızıntı olup olmadığını düzenli olarak kontrol edin. </li><li> Miniblotter su ve deterjanla Pyroneg yıkayın, durulayın ve kurumasını bekleyin. </li><li> Rulo tüpten membran çıkarın. 2xSSPE/0.5% SDS kalan 42 ° C&#39;de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez 2xSSPE yıkayın. </li><li> 80 kadar fırında öncesi sıcak ° C ve yer 500ml% 1 SDS fırın. Çevirin </li><li> Makyaj 15 ml Amersham ECL algılama solüsyonu (7.5 ml çözelti A ve B çözeltisi 7.5 ml). 2xSSPE ve algılama çözümü eklemek atın. 2 dakika çözümü ile membran tam kapsama sağlamak için elle hafifçe sallayın. Kemilüminesan çözüm atın. </li><li> Pozlama kartuş uygun plastik şeffaflık iki yaprak kesin. Iki yaprak ve maruz kalma kartuş yerleştirmek arasında yer membran. </li><li> Karanlık oda için devam edin. Kırmızı ışık altında, kartuş ECL algılama filmi ekleyin ve 5 dakika boyunca maruz. Film izlerken doğru yönde izin kaldırılması üzerine Dog-kulak, sağ alt köşede. </li><li> Başına üreticinin yönergelerini gibi otomatik geliştirici ya da kimyasal banyoların film geliştirin. </li><li> Gerekirse daha uzun veya daha kısa pozlama süreleri ile pozlama tekrarlayın. </li></ol> 3. Membran rejenerasyonu <ol><li> 80 ° C&#39;de 30 dakika boyunca iki kez 250 ml% 1&#39;lik SDS membran yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 240 ml 20 mM EDTA membran yıkayın. </li><li> Seal plastik bir torba içinde 10 ml 20 mM EDTA ile membran ve gelecekte yeniden kullanım için 4 ° C buzdolabına. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: En iyi film yerleştirerek, baskılı bir ızgara üzerinde ya da başka görüntü tarama ve BioNumerics (Uygulamalı Matematik, Sint-Martens-Latem, Belçika) gibi yazılım içine ithal görüntülenebilir. Her prob sonucu pozitif ve negatif kontrol probları referans yorumlanması gerekir. Sonuçları en zayıf, negatif veya pozitif olarak sınıflandırılır. Olumlu sonuçlar, sinyal gibi güçlü ya da pozitif bir kontrol probu daha güçlü olduğu. Sinyal yok veya negatif kontrol (arka plan sinyal durumda) eşit olduğu olumsuz sonuçlar. Zayıf sinyal pozitif kontrol probu daha sönük, ancak negatif kontrol daha güçlü olduğu. Zayıf sonuçlar zayıf prob bağlama ya da astar dimer oluşumu non-spesifik sinyaller nedeniyle önde gelen nokta mutasyonu sonucu olabilir. Ilgi hedef başına iki problar kullanılarak, tek bir zayıf bir sonuç, güvenli bir şekilde spesifik olmayan sinyal olarak yorumlanabilir özgüllüğü artırabilir. Herhangi bir şüphe kalırsa, tek bir karmaşık PCR reaksiyonu, herhangi bir amplifikatöre jel tabanlı algılama ve sıralama ile yapılabilirsonuç gerçekten olumlu olup olmadığını belirlemek için ürün lified. Bir temsilci sonucu Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 mPCR / RLB ilkeleri (P1) Adım 1.9. Amine modifiye probları bir naylon membrana kovalent bağlıdırlar. (P2) Adım 2.10. Biotin modifiye PCR ürünleri probları melezleşmiştir. (P3) Adım 2.14. Peroxidase ile işaretlenmiş Streptavidin, membran ile inkübe ve biotin bağlanır. (P4) 2,19-2,21 Adımlar. Peroksidaz ışık, ışığa duyarlı film maruz kaldığı üreten, ECL algılama reaktifler bir reaksiyonu katalizler. Membran sonra tekrar kullanmak için yıkanır. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 Temsilcisi mPCR / RLB sonucu. Örnekler 1 - 6 arasındaki pozitif kontrol temsil aralarında 43 probları her biri için en az bir pozitif prob sinyali var. Her hedef dizisi (U yoluyla), özgüllüğü en üst düzeye çıkarmak için iki farklı problar ile tespit edilmiştir. A1 ve A2 Problar her numune için olumlu ve filmin yönlendirme yardımcı bekleniyor türe özgü probları temsil eder. Probe A1 zarının alt kısmında tekrarlanır. 7 ve 8 Örnekleri negatif kontrol. Problar S1, S2, T1 ve T2, astarlar veya astar dimer ürün muhtemel nonspesifik bağlanma gösteren negatif kontroller sinyal olduğunu unutmayın. Bu problar veya primerlerin yeniden dizayn gerekli olacaktır. Problar C1, D1 ve streptavidin-peroksidaz konjuge veya kemilüminesan substrat bazı non-spesifik alımı nedeniyle olasılıkla zarından şeritli F1 göstermek, ancak bu gerçek pozitif prob sinyalleri kolayca ayırt edilir. Problar D1 ve D2 diğer problar göre nispeten zayıf bir sinyal var, bu daha az verimli amplifikasyon önde gelen büyük amplikonlarının nedeniyle olabilir. Probe J2 negatif prob J1 olumlu birkaç örnek (1, 3, 4, 6, 39). Bu büyük olasılıkla, bu örnekler için J2 bağlayıcı sitesinde bir mutasyon temsil eder.

<ol>
	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay.">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li><li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium,+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization.">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li><li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li><li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li><li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses.">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species.">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li><li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens.">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li><li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay.">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis.">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li><li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MPCR / RLB yöntemi PCR amplikonlarının çok sayıda eş zamanlı algılama izin verir. Çünkü, kemilüminesan prob-bazlı saptama yüksek hassasiyet, çok sayıda primer çiftleri ile tek bir multipleks PCR reaksiyonu DNA örneğinin yükseltmek için kullanılabilir. Prob sinyalleri kalan PCR ürünü ile jel elektroforezi gerçekleştirirken, bir veya daha fazla numune ile elde edilen PCR veya prob hibridizasyon sorunu olup olmadığını ayırt yardımcı olabilir. Membran tüm prob sinyalleri zayıf veya yok, ama jel elektroforezi başarılı PCR gösterir, olasılıklar membran etiketleme ile ilgili sorunlar, bir önceki kullanımdan sonra membran yanlış rejenerasyon, hibridizasyon veya streptavidin inkübasyon sırasında yanlış sıcaklıklarda, ya da kusurlu streptavidin peroksidaz konjuge veya algılama reaktif. Kontrol örnekleri, bireysel probları yanlış negatif sinyaller, jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama ile tek PCR PCR ürün amplifikasyon doğrulamak ve prob bağlama yerinde dizisi varyasyon bakmak için yapılabilir üreten olabileceğini göstermektedir. Zayıf ya da hiç prob sinyali geniş Amplikon boyutuna bağlı olabilir: Mümkünse tüm amplikonlarının benzer uzunluğu ve 300 bp den az olmalıdır. Amplikonlarının İkincil DNA yapılarını da kötü prob bağlama üretebilir ve astar yeniden tasarlamak gerekebilir. Bireysel primer veya prob konsantrasyonları da sinyal gücünü optimize etmek için farklı olabilir. Nonamplified astarlar veya primer-dimer ürün bağlayıcı prob nedeniyle yanlış pozitif sinyaller tek PCR jel tabanlı algılama ve daha sonraki sıralama yaparak incelenmiştir. Bu durum oluşursa, gerekli olabilecek problar yeniden tasarımı. Prob bağlanma yerleri nokta mutasyonlarının, zayıf ya da hiç sinyal yol açabilir. Amplifiye her ürün için iki probları tespit etmek bu kadar kolay hale getirir. Bu özellik dikkatli astar ve prob tasarımı ile küçük hedef DNA dizisi değişimleri tespit etmek için yararlanılabilir. Ürün algılama aşağıdaki multipleks PCR reaksiyonları pek çok yöntem varken Özetle, mPCR / RLB düşük kurulum maliyeti ile yüksek verimli ve ucuz olma avantajına sahiptir. Yöntemi esneklik, geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılmasına izin verir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 5 &#39;amin C6 değiştirilmiş oligonükleotid problar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0.5 M çözüm pH 8.4 kadar yapılan </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0.1M çözümü </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampon </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> % 10 stok solüsyonu Makyaj, otoklav, 1 hafta kullanmadan önce maksimum tutulmalıdır </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Makyaj, pH 8.0 ve otoklav ayarlanabilir 0.5 M çözüm </td></tr><tr><td> N-(3-Gaz sistemlerinde)-N &#39;ethylcarbodiimide hidroklorür (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> 3.2 g EDAC ve 18 ml Millipore su ile kullanımdan hemen önce 20 ml% 16 çözüm Makyaj </td></tr><tr><td> BiodyneC 0.45 mikron naylon Membran 20x20 cm </td><td> PALL yaşam bilimleri </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deiyonize, arıtılmış su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıvı Pyroneg deterjan </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-peroksidaz konjuge </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL algılama reaktifleri </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL algılama reaktifleri </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Tepegöz Şeffaflık film </td><td> Kurumsal Express </td><td> EXP 504 Tepegöz </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hyperfilm ECL yüksek performans kemilüminesan film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Buz </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sarf mPCR / RLB tayininde kullanılır. <table border="1"><tbody><tr><th> Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Fırınlar (2) yuvarlanan şişe ve naylon ayıran örgü </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Yöntem 42 çözümler korumak için mümkün olduğu sürece tek bir fırın ile yapılabilir ° C ve 60 ° C önceden </td></tr><tr><td> Belly Dancer sallanan platformu </td><td> Stovall hayat Bilim </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Emme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot plate </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pozlama kartuş </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray film geliştirici </td><td></td><td></td><td> Karanlık bir odada yerine otomatik tepsileri geliştirici, sorun çözücü ve su kullanabilir miyimgeliştirici. Lumino-görüntüleyici ayrıca Xray film yerine kullanılıyor olabilir </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ekipman mPCR / RLB testi için gereklidir.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Line Blot Hibridizasyon tahlil yeniden kullanılabilir bir naylon membran, prob hibridizasyon bir multipleks PCR reaksiyonu kullanılarak 43 örneklerinde 43 moleküler hedeflere kadar algılanmasını sağlar. Problar 5 &#39;amin membran fiksasyonu sağlayacak şekilde değiştirilmiştir. Astarlar streptavidin-peroksidaz ve ışığa filmi üzerinden bir kemilüminesan substrat kullanarak melezleşmiş PCR ürünlerinin algılanmasını sağlar 5 &#39;biotin değiştirilmiş. Düşük kurulum ve tüketim giderleri ile bu tekniği ucuz (yaklaşık US $ 2 örnek), yüksek verimlilik (aynı anda birden fazla membranlar işlenebilir) ve kısa bir geri dönüş süresi (yaklaşık 10 saat) sahiptir. Bu teknik, bir kaç yolu kullanılabilir. Çoklu problar, tek bir amplifiye ürün içinde sıra varyasyonu tespit etmek için tasarlanmış olabilir, ya da sonraki tespiti için kullanılan bir (veya daha fazla) probları ile aynı anda birden fazla ürün yükseltilecek. Her iki yaklaşım da bir arada tek bir tahlil içinde de kullanılabilir. , Tek bir hedef sırası için birden fazla probları içerecek şekilde tahlil yeteneği son derece özel kılar. Yayınlandı mPCR / RLB uygulamaları metisiline dirençli Staphylococcus aureus 3-5 ve Salmonella sp 6, moleküler, Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 ve enterovirüslerin 10,11, kimlik serotipleme yazmaya, antibiyotik direnç genleri 1,2 tespit Mycobacterium sp 12, 13-15 genital ve solunum yolu 16 ve diğer 17 patojenler ve algılama ve mollicutes 18 tanımlama tespit. Ancak, tekniğin çok yönlülük uygulamaların neredeyse sınırsız ve mikro-organizmaların moleküler analizi ile sınırlı değildir anlamına gelir. MPCR / RLB beş adım a) Primer ve Prob tasarım, b) DNA ekstraksiyonu ve PCR c) membran hazırlanması, d) Hibridizasyon ve algılama, e) Membran Rejenerasyon.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K Görüntüleme.  University of Sydney. 43 kadar moleküler hedeflere eş zamanlı olarak algılanması için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi açıklanmıştır. MPCR / RLB Uygulamaları mikrobiyal yazarak ve klinik örneklerde birden fazla patojenlerin tespiti içerir.

Video: Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

MCF-7 Hücre Line Nanogenomedicine Hücresel Toksisite: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Biyoloji

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Mikroarray&#39;ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.