Mateus O&#39;Sullivan e Fei Zhou são destinatários da Australian National Saúde e Pesquisa Médica do Conselho de Pós-Graduação Bolsas de Investigação Médica.

Consideração cuidadosa deve ser dada a cartilha eo projeto da sonda. Todas as seqüências disponíveis dos alvos de interesse de bancos de dados, tais como GenBank devem ser utilizados para identificar as áreas de conservação que são alvos adequados. Onde um grande número de alvos estão sendo amplificado em um ensaio mPCR única, cada seqüência amplificada deve ser de comprimento similar, e não deve exceder 300 pares de base para evitar a concorrência. Uma aplicação alternativa do método é para amplificar um alvo usando primers mais para as regiões conservadas e usar sondas múltiplas para identificar a variação de seqüência dentro do amplicon. Neste caso, o produto amplificado PCR pode ser mais longo. Temperaturas de recozimento Primer devem ser todos semelhantes, com condições de PCR ajustados em conformidade. Primers que formam estrutura secundária forte ou dímeros de primer deve ser evitado. A Sigma Aldrich DNA calculadora ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) pode ser usado para prever com segurança esses recursos. Sondas de DNA deve ser projetado para ter annealing temperaturas próximas a 60 ° C. Para maximizar a especificidade, duas sondas para cada alvo de interesse podem ser incluídos no ensaio, uma hibridação para a cadeia de DNA para a frente junto ao local de primer reverso de ligação, ea outra para a vertente inversa adjacente ao local da cartilha frente vinculativo. Neste caso, ambos os primers para a frente e reversa deve ser biotina-modificados. Se apenas uma sonda por alvo amplificado está sendo usado, então, apenas um primer precisa ser modificado biotina. Ao projetar primers e sondas para o ensaio mPCR / RLB é altamente recomendável para uso em métodos para prever silico produtos de PCR e hibridização da sonda para correlacionar com os resultados in vitro. Idealmente isto é feito utilizando isolados para os quais a seqüência do genoma inteiro está disponível. Software, tais como FastPCR (disponível em http://primerdigital.com/fastpcr.html) pode ser usado para esta finalidade. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser previsto quando da análise silico indica descasamentos de pares de bases resultando em temperaturas baixas sonda recozimento. Técnicas de extração de DNA irá variar de acordo com as amostras sendo testadas, e as condições de PCR será dependendo do desenho de primer. Os leitores são referidas publicações sobre ensaios individuais para obter mais informações sobre a extração de DNA e reagentes PCR e condições 1-19. Cada ensaio é executado com controles adequados para fornecer pelo menos um sinal da sonda positivo e um negativo para cada sonda na membrana, bem como um DNA sem controle. Além disso, é benéfico para incluir uma sondagem na parte superior da membrana que se espera que seja positiva para todas as amostras (por exemplo: uma espécie ou gênero sonda específica no caso de um microrganismo). Isto serve como uma sonda de controlo positivo, mas também permite a fácil orientação dos resultados. 1. Preparação de Membrana <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml NaHCO 3 0,5 M </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - realizada em banho-maria a 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pré-aquecer o forno a 60 ° C. </li><li> Limpe o Miniblotter Immunetics com etanol 70%. </li><li> Diluir a sondas de oligonucleotídeos em 0,5 M NaHCO 3 para uma concentração final de 2 pmol / mL e um volume de 200 mL. </li><li> Corte de uma membrana de nylon BiodyneC para cm 15x15. Com um lápis e régua, regra fora de um espaço de 0,5 cm através da parte superior da membrana e escrever detalhes aqui. </li><li> Membrana de vedação em saco plástico com 20 ml solução EDAC acabado de fazer 16% e rock em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Lavar membrana em água desionizada por 30 segundos. </li><li> Membrana lugar em miniblotter com canais que atravessam a membrana (paralela à linha de lápis). Coloque almofada de apoio no lugar e mata-borrão perto. Aspirado de secreção dos canais. </li><li> Preencha raias 1 e 45 com 150 mL 0,5 M NaHCO 3. Usar 150 mL de cada solução de sonda para encher pistas 2-44 em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Se uma bolha de ar aparece no canal, mantendo a pipeta no lugar, rapidamente aspirar a solução para permitir que a bolha de ar para flutuar para o topo da pipeta, tente novamente. Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Aspirar soluções sonda, retirar e lavar membrana em 250 ml de NaOH 0,1 M à temperatura ambiente durante 9 minutos. </li><li> Lavar membrana em 250 ml 2xSSPE por 30 segundos. </li><li> Lavar membrana em 250 ml pré-aquecido SDS 2xSSPE/0.1% em estufa a 60 ° C por 5 minutos. </li><li> Se não estiver sendo usado para a hibridização de imediato, lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 20 minutos (reservando 10 ml restantes), então selo membrana em saco plástico com 10 ml restantes 20 mM EDTA e store em geladeira a 4 ° C. </li><li> Lavar com miniblotter Pyroneg detergente e escova. Enxaguar e deixar secar. </li></ol> 2. Hibridação e Detecção <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - loja em banho-maria a 60 ° C. </li><li> 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - loja em banho-maria a 60 ° C </li><li> 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - armazenamento em estufa a 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - manter a temperatura ambiente </li><li> 500 ml SDS 1% - loja em banho-maria a 60 ° C, inicialmente (para o passo 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - armazenar à temperatura ambiente (para o passo 3). </li></ul></li><li> Ligue uma estufa a 60 ° C e um forno a 42 ° C. Trazer a água para ferver em um copo grande numa placa de aquecimento. </li><li> Immunetics Miniblotter limpa com etanol a 70%. </li><li> Alíquota de 10 ml de SDS 2xSSPE/0.1% em um pequeno frasco. Adicionar 20 l de cada produto de PCR de 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% em tubos numerados. </li><li> Ferva produtos de PCR por 10 minutos a 100 ° C usando titulares de isopor. Colocar no gelo imediatamente para pelo menos 5 minutos. </li><li> Lavar membrana em 240 ml restantes SDS 2xSSPE/0.1% em 60 ° C forno por 5 minutos. </li><li> Membrana lugar em miniblotter com almofada de apoio. Orientar para que os canais correm verticalmente (perpendicular à linha de lápis). </li><li> Líquido de sucção excesso de canais miniblotter. </li><li> Adicionar restantes 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% a canais primeiro e último. Adicionar produtos cozidos PCR para os canais restantes (2-44) em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Miniblotter lugar apartamento em 60 ° C forno por 1 hora para permitir a hibridação a ter lugar. </li><li> Líquido aspirado de cada canal, em seguida, remover membrana de miniblotter. </li><li> Lavar duas vezes na pré-aquecido 250 ml SDS 2xSSPE/0.5% em 60 C ° forno por 10 minutos. </li><li> Umedeça com malha de nylon separando SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e usá-lo para enrolar membrana. </li><li> Lugar de membrana enrolada em tubo de rolo, e desfraldar para garantir membrana confina com a superfície interior. Adicione 3 conjugado estreptavidina-peroxidase mL (Roche Applied Science) a 15 ml SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e adicionar ao tubo de rolo. Parafuso da tampa firmemente e incubar em estufa de rolos a 42 ° C por 60 minutos. Garantir a direção do rolo é tal que a membrana não aperte. Verifique periodicamente se há vazamentos. </li><li> Lavar miniblotter Pyroneg em água e detergente, enxaguar e deixar secar. </li><li> Remover membrana de tubo cilíndrico. Lavar duas vezes em permanecer 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C por 10 minutos. </li><li> Lavar duas vezes em 2xSSPE em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Ligue o forno até 80 ° C e colocar 500ml SDS 1% em forno pré-aquecido. </li><li> Compõem 15 ml Amersham solução de detecção ECL (7,5 ml da solução A e 7,5 ml de solução B). Descartar 2xSSPE e adicione solução de detecção. Rocha suavemente com a mão durante 2 minutos garantir a cobertura completa da membrana com a solução. Eliminar a solução quimioluminescente. </li><li> Corte duas folhas de plástico transparente para caber cartucho de exposição. Membrana lugar entre as duas folhas e coloque em cartucho de exposição. </li><li> Proceder à câmara escura. Sob luz vermelha, adicione filme detecção ECL para cartucho e expor por 5 minutos. Da orelha do cão-canto inferior direito do filme após a remoção para permitir a orientação correta ao ver. </li><li> Desenvolver filme com desenvolvedor automatizado ou banhos químicos como os sentidos do fabricante. </li><li> Repita exposição com tempos de exposição mais longos ou mais curtos, se necessário. </li></ol> 3. Regeneração da membrana <ol><li> Lavar membrana em 250 ml SDS 1% a 80 ° C por 30 minutos duas vezes. </li><li> Lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Membrana de vedação em saco plástico com 10 ml de EDTA 20 mM e refrigerar a 4 ° C para futura reutilização. </li></ol> 4. Resultados representativos: Os resultados são melhores vistos por colocar o filme sobre uma grade impressa, ou digitalizar a imagem e importar para software, tais como BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Cada resultado sonda deve ser interpretada com referência à sonda de controlo positivo e negativo. Os resultados são os melhores classificados como negativo, fraco ou positivo. Resultados positivos são o lugar onde o sinal é tão forte quanto ou mais forte que a sonda de controlo positivo. Resultados negativos são o lugar onde o sinal está ausente ou igual ao controle negativo (no caso de sinal de fundo). Resultados fracos são o lugar onde o sinal é mais fraco do que a sonda de controlo positivo, mas mais forte do que o controle negativo. Resultados fracos pode ser o resultado de mutações pontuais levando a sonda de ligação fraca, ou devido a sinais não-específicos da formação de dímero primer. Usando duas sondas por alvo de interesse pode melhorar a especificidade, onde um único resultado fraco pode seguramente ser interpretado como não-específica do sinal. Se subsistirem dúvidas, a única reação de PCR-plex pode ser realizada com gel com base em detecção e seqüenciamento de qualquer amplificadorlified produto para determinar se o resultado é verdadeiramente positivo. Um resultado representativo é mostrado na figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Passo Os princípios mPCR / RLB (P1) 1.9. Sondas amina modificados são obrigados covalentemente a uma membrana de nylon. (P2) Passo 2,10. Produtos biotina modificada PCR são cruzados para as sondagens. (P3) Passo 2,14. Estreptavidina, marcado com peroxidase, é incubado com a membrana e se liga a biotina. (P4) Passos 2,19-2,21. Peroxidase catalisa uma reação no reagentes de detecção ECL, produzindo luz a que filme sensível à luz é exposta. A membrana é lavada para reutilização. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Representante resultado mPCR / RLB. Amostras de 1 a 6 representam os controles positivo - entre eles há pelo menos um sinal positivo para a sonda de cada uma das 43 sondas. Cada seqüência alvo (de A a U) é detectado com duas sondas diferentes para maximizar a especificidade. Sondas A1 e A2 representam sondas espécie-específicos que devem ser positivos para cada amostra e ajudar com orientação do filme. Sonda A1 é repetido na parte inferior da membrana. Amostras 7 e 8 são controles negativos. Note-se que Q1 Sondas, Q2, T1 e T2 têm sinal nos controles negativos, indicando provável ligação não específica de primers ou produto dímero primer. Re-design dessas sondas ou primers seria necessário. Sondas C1, D1 e mostrar F1 cruzando a membrana provavelmente devido a alguma absorção não-específica do conjugado estreptavidina-peroxidase e substrato quimioluminescente, porém isso é facilmente distinguida da verdadeira sonda sinais positivos. Sondas D1 e D2 têm sinal relativamente fraco em comparação com outras sondas, isto pode ser devido ao maior amplicons levando a amplificação menos eficiente. Sonda J2 é negativo é várias amostras (1, 3, 4, 6, 39) onde sonda J1 é positivo. Esta provavelmente representa uma mutação no site J2 ligação para esses exemplos.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método mPCR / RLB permite a detecção simultânea de um grande número de amplicons PCR. Devido à alta sensibilidade de detecção da sonda baseada quimioluminescente, a única reação de PCR multiplex com grande número de pares de primers podem ser usados ​​para amplificar o modelo de DNA. Se não houver sinais de sonda são obtidos com uma ou mais amostras, realização de eletroforese em gel com qualquer produto PCR restantes podem ajudar a distinguir se o problema é com a amplificação ou a hibridização da sonda. Onde todos os sinais da sonda na membrana são fracos ou ausentes, mas indica eletroforese em gel de amplificação por PCR de sucesso, possibilidades incluem problemas com a rotulagem de membrana, a regeneração incorreta da membrana após o uso anterior, as temperaturas incorretas durante a incubação de hibridação ou estreptavidina, ou com defeito estreptavidina- conjugado peroxidase ou reagente de detecção. Se as amostras de controle indicam que as sondas individuais podem estar produzindo falsos sinais negativos, a PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subseqüente pode ser realizado para verificar a amplificação do produto de PCR e de olhar para a variação de seqüência no local da sonda de ligação. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser devido ao tamanho do amplicon grande: se possível todos os amplicons deve ser de comprimento similar e menos de 300 bp. Estruturas secundárias de DNA amplicons também pode produzir vinculativo sonda pobres, e pode necessitar de re-design de primers. Cartilha individuais ou concentrações de teste também pode ser variado para otimizar a força do sinal. Falso-positivos devido à ligação dos primers sonda não amplificados ou primer dimer-produto pode ser investigado através da realização de PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subsequente. Se isso ocorrer, o redesenho das sondas podem ser necessárias. Mutações pontuais em locais de ligação da sonda pode levar a sinais fracos ou ausentes. Permitindo duas sondas para cada produto amplificado torna isso fácil de detectar. Esta característica pode ser explorada com primer cuidadoso e design sonda para detectar variações na seqüência pequena do DNA alvo. Em resumo, embora existam muitos métodos de detecção de produto seguintes reações multiplex PCR disponíveis, mPCR / RLB tem a vantagem de ser de alto rendimento e baixo custo de instalação com baixo-custo. A flexibilidade do método permite a sua utilização em uma ampla gama de aplicações.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 5 &#39;amina C6 modificada sondas de oligonucleotídeos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> Solução 0,5 M feitas até pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M solução </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampão </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Compõem solução estoque 10%, não autoclave, deve ser mantida por 1 semana no máximo antes de usar </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Compõem solução 0,5 M ajustada a pH 8,0 e autoclave </td></tr><tr><td> N-(3-dimetilaminopropil)-N &#39;ethylcarbodiimide-cloridrato (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Compõem a 20 ml de solução 16% pouco antes de usar usando 3,2 g EDAC e 18 ml de água Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 mM centímetros de membrana de nylon 20x20 </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionizada, água purificada </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Detergente líquido Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-peroxidase conjugada </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detecção de reagentes </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detecção de reagentes </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Transparências OHP </td><td> Corporate Express </td><td> OHP EXP 504 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham hyperfilm ECL alto desempenho filme quimioluminescente 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Gelo </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Consumíveis utilizados no ensaio mPCR / RLB. <table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Hybaid Fornos Shake&#39;n&#39;Stack (2) garrafa rolando e tela de náilon que separa </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Método pode ser realizado com um único forno, desde que haja facilidade para manutenção de soluções a 42 ° C e 60 ° C antes do uso </td></tr><tr><td> A plataforma de balanço Belly Dancer </td><td> Stovall ciências da vida </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sucção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chapa elétrica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cartucho de exposição </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray desenvolvedor filme </td><td></td><td></td><td> Também pode usar fixador desenvolvedor, e água em bandejas, em quarto escuro em vez de automáticodesenvolvedor. Lumino-imager também pode ser usado em vez do filme de Raio X </td></tr></tbody></table> Equipamentos tabela 2. Necessárias para o ensaio mPCR / RLB.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Linha ensaio de hibridação Blot permite a detecção de até 43 alvos moleculares em 43 amostras, utilizando uma reação de PCR multiplex seguida de hibridização da sonda em uma membrana de nylon, que é reutilizável. Sondas são 5 &#39;amina modificada para permitir a fixação à membrana. Primers são 5 &#39;biotina modificados que permite a detecção de produtos hibridizados PCR usando estreptavidina-peroxidase e um substrato quimioluminescente via filme fotossensível. Com uma configuração baixa e custos de consumíveis, esta técnica é barata (cerca de EUA $ 2 por exemplo), alta taxa de transferência (membranas múltiplas podem ser processadas simultaneamente) e tem um tempo de resposta curto (cerca de 10 horas). A técnica pode ser utilizada em um número de maneiras. Sondas múltiplas podem ser projetados para detectar variação da seqüência dentro de um único produto amplificado, ou vários produtos podem ser amplificados simultaneamente, com uma (ou mais) sondas utilizadas para a detecção subseqüente. A combinação das duas abordagens também podem ser usados ​​dentro de um único ensaio. A capacidade de incluir sondas múltiplas para uma seqüência alvo único torna o ensaio altamente específico. Publicado em aplicações de mPCR / RLB incluem a detecção de antibióticos 1,2 genes de resistência, a digitação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina 3-5 e Salmonella sp 6, sorotipagem molecular de Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 e enterovírus 10,11, a identificação de Mycobacterium sp 12, detecção de 13-15 genital e do trato respiratório 16 e outros 17 agentes patogênicos e detecção e identificação de molicutes 18. No entanto, a versatilidade da técnica significa as aplicações são praticamente ilimitadas e não se restringe à análise molecular de microrganismos. As cinco etapas em mPCR / RLB é um Primer) e design Probe, b) extração do DNA e amplificação c) Preparação da membrana, d) Hibridação e detecção e e) Regeneração da membrana.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K visualizações.  University of Sydney. Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Biologia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...